劉夢(mèng)鴿, 徐文芬, 孫慶文, 楊 杭, 劉恩穩(wěn)
(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng)550002)
蜘蛛果來(lái)源于桔??平疱X(qián)豹屬多年生植物長(zhǎng)葉輪鐘草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz 的干燥根,又稱“紅果參” “山荸薺” “算盤(pán)果” 等。味甘而微苦,性平,具有潤(rùn)肺止咳、理氣、補(bǔ)虛、祛瘀止痛等功效,主要用于治療跌打損傷、氣虛乏力、腸絞痛、肺癆咳嗽、疝氣等癥[1-2]。其根在民間常作為滋補(bǔ)草藥,嫩葉可作為蔬菜炒食,果實(shí)可作為水果食用,有一定的保健功效[3]。對(duì)蜘蛛果藥材的研究相對(duì)較少,主要集中在其化學(xué)成分及抗氧化活性的研究[4-9],在質(zhì)量控制方面仍處于空白,不利于控制藥材及其成方制劑的質(zhì)量,無(wú)法保證臨床用藥的安全性和有效性,并限制了對(duì)蜘蛛果的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。
中藥的化學(xué)成分種類繁多,且各成分之間相輔相成,而中藥的質(zhì)量長(zhǎng)期以來(lái)多以單一指標(biāo)進(jìn)行控制,難以真正體現(xiàn)中藥的多效性和整體性。中藥多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)要求對(duì)其進(jìn)行多成分質(zhì)量控制,一測(cè)多評(píng)(QAMS) 中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式為解決該矛盾提供了新思路。QAMS 法是現(xiàn)代發(fā)展起來(lái)的1 種分析技術(shù)和方法[10],即利用有效化學(xué)成分間內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系,測(cè)定1 個(gè)成分(對(duì)照品可廉價(jià)易得者),實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分(對(duì)照品沒(méi)有或難以得到者) 的同步監(jiān)控,使中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)更簡(jiǎn)便并節(jié)約成本,可客觀評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量。目前,QAMS 法已廣泛應(yīng)用于中藥材及中藥制劑的質(zhì)量控制研究中,用于解決缺乏對(duì)照品的問(wèn)題[11-19]。
蜘蛛果為2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 修訂的新增補(bǔ)品種。 本研究應(yīng)用QAMS 法以供應(yīng)量大、價(jià)格較低的綠原酸對(duì)照品為參照物,通過(guò)建立其與木犀草素、芹菜素的相對(duì)校正因子進(jìn)行含有量計(jì)算,以降低檢測(cè)成本和時(shí)間,并為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定、合理開(kāi)發(fā)利用資源等提供研究基礎(chǔ)。
Agilent 1100 型和1260 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);島津LC-2030 型高效液相色譜儀(日本島津公司);Thermo UItiMate 3000 型高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛公司);AG135 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);SG8200HFT 型超聲儀(上海冠特超聲儀器有限公司);202-1A 型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);DK-98-Ⅱ型水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司);色譜柱:Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、 Agilent ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent ZORBA XSB-CN(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 均 購(gòu) 自 美 國(guó) Agilent 公 司;Pntulips BP-C18(4.6 mm×250 mm,5μm) 等。
綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-201716,含有量99.3%)、木犀草素對(duì)照品(批號(hào)111520-201605,含有量99.6%)、 芹菜素 (批號(hào)111901-201603,含有量99.2%) 均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純);磷酸(重慶川東化工有限公司,分析純);實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水; 其他試劑均為分析純。
17 批蜘蛛果藥材分別由課題組采自貴州龍里、獨(dú)山、開(kāi)陽(yáng)、梵凈山以及廣西省融水等地,經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為長(zhǎng)葉輪鐘草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz,按地上部分和地下部分分別處理,藥材均搶水洗,50 ℃烘干,粉碎,置于硅膠干燥器中備用,見(jiàn)表1。
表1 樣品信息Tab.1 Information of samples
2.1 色譜條件 Pntulips BP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈(A) -甲醇(B) -0.1%磷酸(C),梯度洗脫,程序見(jiàn)表2;體積流量1.0 mg/mL;檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL。
表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs
2.2 對(duì)照品溶液制備 取綠原酸、木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量,50%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為1.405、0.202 0、0.206 0 mg/mL 的貯備液,吸取2.0、2.5、0.5 mL,置于5 mL 量瓶中,定容,即得(三者質(zhì)量濃度分別為0.562 0、0.101 0、0.020 6 mg/mL)。
2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末1.0 g,精密稱定,置于50 mL 錐形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,超聲(100 W、40 Hz)提取60 min,取出放至室溫,濾過(guò),續(xù)濾液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜,即得。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性考察試驗(yàn) 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.3” 項(xiàng)下供試品溶液各10 μL,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果表明,供試品圖譜中1、2、3 號(hào)色譜峰的保留時(shí)間與混合對(duì)照品溶液一致,且UV 光譜圖曲線相同, 其純度因子分別為 999.916、999.891、999.155,表明該方法具有良好的專屬性,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents
2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,分別稀釋成系列質(zhì)量濃度(綠原酸,0.351 3、0.175 6、0.087 80、0.043 90、0.022 00 mg/mL;木犀草素,0.101 0、0.050 50、0.025 25、0.012 62、0.006 312 mg/mL;芹菜素,0.041 20、0.016 48、0.006 592、0.002 637、0.000 527 4 mg/mL),在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,平行3 次。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents
2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)得綠原酸、木犀草素、芹菜素峰面積RSD分別為0.26%、0.74%、0.26%,表明儀器精密度良好。
2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(Z7)10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、3、6、8、12、24、48 h 進(jìn)樣,測(cè)得綠原酸、木犀草素、芹菜素峰面積RSD 分別為0.67%、1.51%、1.94%,表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品(Z7) 6 份,每份約1.0 g,精密稱定,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得綠原酸、木犀草素、芹菜素含有量RSD 分別為2.59%、1.41%、2.55%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的藥材粉末(Z7)6 份,每份約0.5 g,精密稱定,分別精密加入綠原酸、木犀草素、芹菜素對(duì)照品溶液適量,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,測(cè)得三者平均加樣回收率分別為96.00%、96.34%、95.93%,RSD 分別為1.54%、2.45%、2.53%。
2.5 相對(duì)校正因子 取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,精密吸取2、4、6、8、10、12 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,以綠原酸為內(nèi)標(biāo),根據(jù)校正因子公式fsi=fs/fi= (As×Ci) / (Ai×Cs) (As、Cs分別為內(nèi)參物的峰面積和濃度,Ai、Ci分別為待測(cè)成分的峰面積和濃度,fsi為待測(cè)成分的相對(duì)校正因子)分別計(jì)算綠原酸對(duì)木犀草素和芹菜素的相對(duì)校正因子(fS/B為木犀草素的相對(duì)校正因子,fS/C為芹菜素的相對(duì)校正因子),發(fā)現(xiàn)其RSD 均小于5.0%,見(jiàn)表4。
表4 木犀草素、芹菜素校正因子(n=6)Tab.4 Relative correlation factors of luteolin and apigenin(n=6)
2.6 耐用性考察
2.6.1 儀器、色譜柱 選擇4 種型號(hào)高效液相色譜儀和3 種型號(hào)色譜柱,精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得木犀草素、芹菜素相對(duì)校正因子分別在0.578~0.617、0.471~0.551 之間,不同儀器、色譜柱相對(duì)校正因子RSD 分別為2.222%、3.793%,表明對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著性影響,結(jié)果見(jiàn)表5。
2.6.2 待測(cè)組分色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)考察4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室中不同型號(hào)儀器、色譜柱下的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間,發(fā)現(xiàn)各成分保留時(shí)間差波動(dòng)較小,RSD 分別為1.93%、3.03%;相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較大,RSD 分別為6.25%、5.39%,因此采用保留時(shí)間差法定位木犀草素、 芹菜素色譜峰, 結(jié)果見(jiàn)表5。
2.7 樣品含有量測(cè)定 取17 批樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算3 種成分的含有量,并對(duì)2 種方法測(cè)定值進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表6。
表5 相對(duì)校正因子、保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間考察結(jié)果(n=3)Tab.5 Results of investigation on relative correlation factors,retention time differences and relative retention time(n=3)
3.1 流動(dòng)相優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)峰形較差。在此基礎(chǔ)上,又考察了甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%磷酸流動(dòng)相體系及其比例,結(jié)果顯示,以甲醇-乙腈-0.1 磷酸水為流動(dòng)相時(shí),待測(cè)成分色譜峰峰形較好,分離度≥1.5。
3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 本實(shí)驗(yàn)對(duì)綠原酸、木犀草素、芹菜素溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn), 三者在340 nm波長(zhǎng)下均有較好的吸收,而且基線平穩(wěn),色譜峰峰形較好,故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
3.3 制備方法優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑(50%、75%、95%甲醇,75%乙醇)、 制備方式(超聲、回流提取)、提取時(shí)間(30、45、60 min)等,以各成分提取率和色譜峰分離情況為指標(biāo),同時(shí)考慮到樣品制備的便捷性,最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。
表6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含有量測(cè)定結(jié)果比較(n=3)Tab.6 Comparison of content determination results obtained by ESM and QAMS methods(n=3)
本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定蜘蛛果藥材中綠原酸、 木犀草素、 芹菜素的含有量。 再采用SPSS16.0 軟件,對(duì)外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法所測(cè)的蜘蛛果中木犀草素、芹菜素含有量進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),結(jié)果P>0.05,表明2 種方法所得結(jié)果無(wú)顯著性差異,準(zhǔn)確可靠。而且,該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確,相對(duì)校正因子具有良好的可信度和準(zhǔn)確度,同時(shí)有效降低了分析成本,可為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供有力支持。
此外,不同采收時(shí)間的蜘蛛果中3 種成分含有量均存在顯著差異。據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)可知,從1 月到7月呈下降趨勢(shì);不同產(chǎn)地采收的藥材中3 種成分含有量同時(shí)高或同時(shí)低,其變化趨勢(shì)相同,見(jiàn)圖2 ~3,可初步判斷不同采收期、產(chǎn)地對(duì)其影響較大,不同季節(jié)、環(huán)境因素也可能影響其變化,但還需要更多樣本來(lái)驗(yàn)證此推斷。本研究結(jié)果對(duì)蜘蛛果種質(zhì)資源引種、規(guī)范化種植、采收時(shí)間等方面研究提供了前期基礎(chǔ)。
圖2 不同采收期樣品中3 種成分含有量變化趨勢(shì)Fig.2 Trends of content changes of three constituents in samples at different picking time
圖3 不同產(chǎn)地樣品中3 種成分含有量變化趨勢(shì)Fig.3 Trends of content changes of three constituents in samples from different growing areas