唐義東， 柳云恩， 樸 瑛

1.遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院，遼寧沈陽110032；北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院

2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室；

3.腫瘤科，遼寧沈陽110016

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染人群中少數(shù)可發(fā)展為慢性胃炎和消化性潰瘍，嚴重者甚至可發(fā)展為胃癌[1]。有研究顯示，H.pylori不同的致病能力可能與其疾病來源和基因亞型有關[2]。蒙古沙土鼠(Mongolian gerbils，MGs)的腺胃結構和功能與人類相似，自發(fā)性胃炎的發(fā)生率極低，其可為H.pylori誘導的慢性活動性胃炎、胃癌的發(fā)展等研究提供了可用的動物模型[3]。幾種天然產物如菜籽油、咖啡酸苯乙酯及蜂膠提取物等對H.pylori誘導的MGs相關性胃炎和胃癌有抑制作用[4]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，MGs感染潰瘍分離株TN2GF4后會造成明顯的炎癥、潰瘍及腺癌等病理改變，而MGs被潰瘍分離株7.13感染14周后，近1/3的MGs發(fā)生高分化腺癌，18周后，將近半數(shù)的MGs發(fā)生高分化腺癌，其子代菌株B128僅能導致MGs發(fā)生輕度潰瘍和胰腺炎[5-6]。本研究旨在探討不同疾病來源H.pylori對MGs胃黏膜損傷的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 雄性SPF級MGs 30只，6周齡，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心。動物飼養(yǎng)在室溫(20℃ ±2℃)，相對濕度40% ～60%，12 h明暗循環(huán)的標準實驗室環(huán)境。自由攝食、飲水。動物觀察及適應環(huán)境7 d。不同疾病來源的H.pylori購自中國醫(yī)科大學腫瘤研究所。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗動物分組及胃黏膜損傷模型建立 將30只MGs隨機分為對照組、胃炎H.pylori組(胃炎株組)和胃癌 H.pylori組(胃癌株組)，每組各10只。胃炎株組和胃癌株組MGs禁食禁水12 h后，分別將含不同疾病來源H.pylori的生理鹽水1.0 ×108CFU/ml灌胃 l ml，每日1 次，連續(xù)3 d，對照組僅灌生理鹽水。接種H.pylori后禁食12 h，4 h后自由攝水，連續(xù)觀察26周。

1.2.2 病理學檢查 接種H.pylori后第26周，處死動物。處死前，MGs禁食禁水12 h，乙醚吸入麻醉，對動物胃黏膜進行觀察。由前胃、腺胃至十二指腸縱向切成約1.0 cm×0.4 cm條塊，然后將組織進行石蠟包埋，用于制作病理組織切片。

1.2.3 免疫印跡試驗檢測 采用免疫印跡試驗檢測胃黏膜組織核因子-紅系2相關因子2(Nrf2)、Nqo1和Ho-1蛋白表達。將黏膜組織充分碾碎后，在冰上用溶解緩沖液處理45 min，然后將其在95℃下加熱5 min，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離等量的蛋白質，移至聚偏二氟乙烯膜。將含有5%牛血清白蛋白的緩沖鹽水和TBST阻斷膜1 h后，加一抗孵育，4℃過夜，然后用TBST洗滌3次，加二抗培養(yǎng)2 h，使用增強化學發(fā)光試劑盒發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同疾病來源 H.pylori致 MGs胃黏膜病變 建模第26周，對照組胃黏膜未見任何大體改變；胃癌株組80%動物可見胃黏膜糜爛、潰瘍，潰瘍表現(xiàn)較大，直徑約為10 mm，邊緣顯示不整，伴有黏膜出血，周圍黏膜粗糙；胃炎株組40%動物胃黏膜可見糜爛、潰瘍，潰瘍直徑較小，邊緣整齊。見圖1。

圖1 不同疾病來源H.pylori致MGs胃黏膜大體病變

2.2 不同疾病來源H.pylori致MGs胃黏膜組織病理學改變 鏡下可見，胃癌株組發(fā)生明顯的炎癥細胞浸潤，黏膜糜爛、潰瘍，腸黏膜化生等病理改變；而胃炎株組胃黏膜損傷程度較輕，僅見少量炎癥細胞浸潤，未見明顯的黏膜萎縮改變。胃癌株組和胃炎株組導致黏膜炎癥的發(fā)生率分別80%和40%，黏膜糜爛、潰瘍的發(fā)生率分別為80%和35%，黏膜發(fā)生腺體萎縮、腸化生的概率分別為60%和5%，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 不同疾病來源H.pylori致MGs胃黏膜組織病理學改變

2.3 不同疾病來源H.pylori致MGs胃黏膜Nrf2/Nox4通路蛋白表達 與對照組比較，胃炎株組和胃癌組黏膜Nrf2蛋白的表達增加，Nqo1和Ho-1蛋白的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與胃炎株組比較，胃癌株組Nrf2蛋白的表達增加，Nqo1和Ho-1蛋白的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 不同疾病來源H.pylori致MGs胃黏膜Nrf2/Nox4通路蛋白表達

3 討論

目前，關于H.pylori的持續(xù)定植和H.pylori相關胃炎在胃黏膜中的發(fā)展尚不清楚，但胃上皮細胞與H.pylori誘導的免疫反應間的相互作用是一個關鍵的促因。胃上皮細胞能使免疫細胞產生炎癥反應[7]。本研究比較了胃癌及胃炎H.pylori分離株感染26周后，MGs胃黏膜的損傷程度。結果發(fā)現(xiàn)，第26周，感染胃癌分離株的MGs黏膜及黏膜下層出現(xiàn)明顯的淋巴濾泡，糜爛、潰瘍、腺體萎縮及腸化生等病變，而感染胃炎分離株則病變程度較輕，僅見輕度的炎癥反應等病變。

有研究顯示，H.pylori的定植密度與黏膜炎癥的嚴重程度、炎細胞的浸潤程度有關，而H.pylori的感染時間和定植密度可調節(jié)其致癌作用[8]。H.pylori定植密度及檢出率隨感染時間的延長而逐漸降低，不同疾病來源的菌株造成MGs損傷程度亦有不同[9]。胃癌分離株TK1402可造成MGs黏膜發(fā)生炎癥、萎縮及腸化生等病變；而胃潰瘍分株TN2GF4菌株雖然也會造成MGs黏膜發(fā)生急性胃炎和腸化生等改變，但更容易導致十二指腸炎，不同疾病來源的H.pylori在造成MGs胃黏膜損傷方面比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)[10-12]，與本研究結果相似。有研究顯示，cagPAI＋H.pylori更傾向于誘導MGs黏膜產生潰瘍、萎縮、腸化生及增生性病變[13-15]；而cagPAI-H.pylori易導致MGs發(fā)生糜爛和輕度炎癥反應[16-17]。本研究中所采用的兩種菌株均為cagPAI＋H.pylori菌株，但這兩種菌株的致病性仍然存在較大差異。這提示，cagPAI＋可能只是決定H.pylori致病能力的因素之一。因此，不同疾病來源的H.pylori對MGs黏膜損傷是一個復雜、多因素、多步驟共同作用的結果，其某些關鍵基因的突變和缺失可能會在某種程度上降低其致病能力。Nrf2是含轉錄因子的堿性亮氨酸拉鏈，通過結合順式作用的增強子序列調節(jié)一系列的基礎和誘導表達，發(fā)揮細胞保護和抗氧化作用[18]。在靜態(tài)條件下，Nrf2通過結合其抑制劑KEAP1而保留在細胞質中。如果該結合被破壞，Nrf2會轉移至細胞核，并啟動抗氧化基因的轉錄[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，胃炎株組和胃癌株組MGs黏膜Nrf2蛋白的表達增加，Nqo1和Ho-1蛋白的表達降低；與胃炎株組比較，胃癌株組Nrf2蛋白表達增加，Nqo1和Ho-1蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。這表明，不同疾病來源的H.pylori導致胃黏膜損傷差異可能與Nrf2/Ho-1通路相關。

綜上所述，不同疾病來源的H.pylori對MGs胃黏膜的損傷有明顯不同，胃癌來源的H.pylori對MGs胃黏膜的損傷能力更強，這種損傷差異可能與Nrf2/Ho-1通路的激活有關。胃癌分離H.pylori菌株致病能力的具體分子機制尚有待進一步研究。