鄒敏敏，董其惠，黃 彥，蘇二正

(1.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院 ，江蘇南京210037; 2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210037)

茯磚茶屬黑茶類(lèi)，歷史上主要銷(xiāo)往我國(guó)的西北部邊疆等少數(shù)民族地區(qū)，故又稱(chēng)為“邊銷(xiāo)茶”。茯磚茶生產(chǎn)歷史悠久，始于唐，盛于明清，在漢族與少數(shù)民族的貿(mào)易史上占有十分重要的地位。茯磚茶是一種后發(fā)酵茶，其中冠突散囊菌是產(chǎn)生其特征風(fēng)味的優(yōu)勢(shì)菌種[1]。

冠突散囊菌，俗稱(chēng)為“金花菌”，是屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊屬的一種真菌，對(duì)茯磚茶風(fēng)味品質(zhì)的形成具有重要作用[2]，也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中黑茶種類(lèi)里唯一有“冠突散囊菌”這一指標(biāo)的品種[3]。茯磚茶的營(yíng)養(yǎng)成分非常多，最主要的是維生素、礦物質(zhì)，特別是茶堿的含量較高。其中包括維生素B1、B2、C 等多種水溶性維生素以及Na、K、Fe、Cu、P及F等28 種礦物質(zhì)。茯磚茶中的蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也是飲用者的重要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[4]。長(zhǎng)期飲用茯磚茶，不但可以預(yù)防心腦血管疾病及癌癥，還有明顯的免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等作用[5]。

目前茯磚茶制造中，選用3～4級(jí)黑毛茶為原料，通過(guò)篩分、汽蒸、漚堆發(fā)酵、稱(chēng)茶、蒸茶、壓制、包裝、發(fā)花、干燥、檢驗(yàn)等工序精制而成[6]。雖然有關(guān)茯磚茶固態(tài)發(fā)酵制備技術(shù)已日漸成熟，但是整個(gè)工序步驟繁雜、發(fā)酵發(fā)花時(shí)間長(zhǎng)。此外，由于采用固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵環(huán)境條件控制困難、管理粗放、衛(wèi)生條件差。近年來(lái)，發(fā)酵型茶飲料開(kāi)始在茶飲料市場(chǎng)嶄露頭角。與傳統(tǒng)的茶飲料相比，發(fā)酵型茶飲料有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，比如品質(zhì)成分得到改善，有效成分增多等。盡管當(dāng)前還沒(méi)有發(fā)酵茶飲料國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但是市場(chǎng)上已有參照其他發(fā)酵飲料標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)發(fā)的紅茶菌、乳酸菌發(fā)酵茶飲料。2016年12月7日，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委新食品原料受理系統(tǒng)接受了冠突散囊菌(CGMCC NO.8730)新食品原料申請(qǐng)(衛(wèi)食新申字(2016)第0011號(hào))。

基于上述背景，本研究中，筆者擬以黑毛茶為原料，浸提獲得黑毛茶提取液后接種冠突散囊菌，通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化，使冠突散囊菌在黑毛茶提取液中的生長(zhǎng)繁殖量達(dá)到最大化，旨在為后續(xù)開(kāi)發(fā)冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵茶飲品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑毛茶，湖南竹湘記；冠突散囊菌，保藏于南京林業(yè)大學(xué)發(fā)酵食品實(shí)驗(yàn)室；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，青島霍普生物技術(shù)有限公司；大豆蛋白、乳清蛋白、脫脂奶粉，上海瑞永生物科技有限公司；葡萄糖、果糖、NH4Cl、CaCl2等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冠突散囊菌活化

取出-20 ℃保存的菌種，在無(wú)菌操作臺(tái)上于PDA平板上劃線(xiàn)。在28 ℃、相對(duì)濕度85%的條件下恒溫恒濕培養(yǎng)。培養(yǎng)至平板上長(zhǎng)有金色閉囊殼后(約72 h)，再次挑取邊緣金黃色的菌落接種到新的PDA培養(yǎng)基上。重復(fù)上述操作2～3次。

1.2.2 冠突散囊菌孢子懸液的制備

挑取已培養(yǎng)72 h的冠突散囊菌，轉(zhuǎn)移到盛有無(wú)菌水的三角燒瓶中，加入幾顆玻璃珠，220 r/min振蕩45 min。用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)濃度，使得孢子懸液的密度為4.8×105個(gè)/mL。

1.2.3 黑毛茶提取液的制備

參照文獻(xiàn)[7]的方法。稱(chēng)取3 g磨碎的黑毛茶茶粉，置于1 000 mL的錐形瓶中，加入450 mL煮沸的蒸餾水，沸水浴浸提45 min，每隔10 min搖動(dòng)一次。浸提完成后立即減壓抽濾，去除茶渣后將濾液移至容量瓶中，用蒸餾水定容至500 mL，得到質(zhì)量濃度為6 g/L的黑毛茶提取液。

1.2.4 菌絲干質(zhì)量的測(cè)定

取適量濾紙，80 ℃烘干4 h至質(zhì)量恒定，分別稱(chēng)質(zhì)量并記錄。將發(fā)酵完成的菌液用已稱(chēng)量的濾紙抽濾，濾除濾液，將留有菌絲和孢子的濾紙?jiān)俅畏湃?0 ℃烘箱烘干6 h至質(zhì)量恒定，稱(chēng)量并計(jì)算出菌絲干質(zhì)量[8]。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以不添加任何其他物質(zhì)的黑毛茶提取液(6 g/L)為空白組。碳源種類(lèi)優(yōu)化選用果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和木糖醇等6種，氮源種類(lèi)優(yōu)化選用大豆蛋白、乳清蛋白、脫脂奶粉、尿素、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4和NH4NO3等8種有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源，無(wú)機(jī)鹽選用KCl、ZnSO4、MgSO4、Fe2(SO4)3、NaCl和CaCl2等6種。黑毛茶提取液設(shè)3、6、9、12和15 g/L共5個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行考察。于500 mL三角瓶中裝150 mL培養(yǎng)液，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫后，每個(gè)三角瓶中接種3 mL孢子懸液(4.8×105個(gè)/mL)，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)72 h，測(cè)定菌絲干質(zhì)量，每組3個(gè)平行樣。

1.2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

以最佳培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)裝液量、接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間這4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。接種量設(shè)1、2、3、4、5和6 mL等6個(gè)水平；初始pH設(shè)3、4、5、6、7和8這6個(gè)水平；裝液量設(shè)25、50、75、100、125和150 mL這6個(gè)水平(V(裝液量)∶V(孢子懸液)=50∶ 1)；在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)定菌絲干質(zhì)量，考察發(fā)酵時(shí)間的影響。

1.3 理化成分的測(cè)定

pH直接用pH計(jì)測(cè)定；水浸出物含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]；茶多酚含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]；總黃酮測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]；茶色素測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]；游離氨基酸含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]；游離氨基酸類(lèi)別測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]；香氣成分測(cè)定利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法進(jìn)行分析，具體參照文獻(xiàn)[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.1.1 碳源對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響

碳源在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中起著不可或缺的作用，在微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，常用的碳源有糖類(lèi)、油脂、小分子醇類(lèi)、有機(jī)酸和有機(jī)酸酯等。本文中，筆者選取6種糖類(lèi)作為碳源，冠突散囊菌生長(zhǎng)情況如圖1所示。

圖1 碳源種類(lèi)對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of carbon sources on growth of Eurotium cristatum

由圖1可見(jiàn)：冠突散囊菌在添加碳源的黑毛茶提取液中的生長(zhǎng)情況優(yōu)于空白組，即外加碳源能夠促進(jìn)冠突散囊菌的生長(zhǎng)。其中，葡萄糖的促進(jìn)效果最好，這與劉作易等[16]、尹旭敏[17]的研究結(jié)果一致；麥芽糖的效果次之；果糖、木糖醇和蔗糖的效果相當(dāng)，三者無(wú)顯著性差異；乳糖效果最差。進(jìn)一步對(duì)葡萄糖的添加濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置10、30、50、70和90 g/L這5個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on growth of Eurotium cristatum

由圖2可以看出：冠突散囊菌的菌絲干質(zhì)量隨著葡萄糖濃度的提高而增加，其增長(zhǎng)趨勢(shì)在10 ～70 g/L區(qū)間較為明顯，在70～90 g/L區(qū)間趨于平緩。本實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖質(zhì)量濃度只優(yōu)化到90 g/L，原因一是考慮到呂嘉櫪等[18]提出，過(guò)高的糖濃度會(huì)使冠突散囊菌產(chǎn)生無(wú)性孢子，從而影響到其有性孢子的數(shù)量；二是過(guò)高的糖濃度不利于后期發(fā)酵茶飲品的開(kāi)發(fā)。因此，選取90 g/L葡萄糖為最佳碳源用量。

2.1.2 氮源對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響

冠突散囊菌在生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中，需要氮源來(lái)合成如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等菌體細(xì)胞物質(zhì)。筆者選用了4種有機(jī)氮源和4種無(wú)機(jī)氮源，冠突散囊菌生長(zhǎng)情況如圖3所示。

圖3 氮源種類(lèi)對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources ongrowth of Eurotium cristatum

由圖3可見(jiàn)：有機(jī)氮源中，將尿素添加到黑茶提取液中時(shí)，菌體不生長(zhǎng)，而其他3種均能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，效果從高到低依次是乳清蛋白、大豆蛋白、脫脂奶粉；無(wú)機(jī)氮源中，添加NH4NO3時(shí)菌絲干質(zhì)量最大、(NH4)2SO4次之、NaNO3略高于NH4Cl。該結(jié)果與劉作易[16]的研究相一致。由于3種有機(jī)氮源添加到黑茶提取液中會(huì)使發(fā)酵液變渾濁，從而影響成品外觀，此外，由于明令禁止食品中添加NH4NO3，(NH4)2SO4易與Ca2+形成沉淀等原因，最終選取NH4Cl作為最佳氮源。進(jìn)一步對(duì)NH4Cl質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L這6個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖4所示。

圖4 NH4Cl質(zhì)量濃度對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of ammonium chloride concentration ongrowth of Eurotium cristatum

從圖4可以看出，NH4Cl質(zhì)量濃度在0～7.5 g/L時(shí)，其菌絲干質(zhì)量隨著NH4Cl濃度升高而增加；在NH4Cl質(zhì)量濃度為7.5 g/L時(shí)，達(dá)到最大值；NH4Cl質(zhì)量濃度高于7.5 g/L時(shí)，菌絲干質(zhì)量隨其濃度升高而減小。因此，NH4Cl的最佳質(zhì)量濃度選取7.5 g/L。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響

考慮到發(fā)酵液的可食用性，根據(jù)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)，選擇了CaCl2等6種無(wú)機(jī)鹽，研究其對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of inorganic salts on growth of Eurotium cristatum

由圖5可知，除ZnSO4和Fe2(SO4)3外，其他4種無(wú)機(jī)鹽均能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，其中CaCl2效果最好。比較KCl、NaCl和CaCl2對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響，表明 Cl-對(duì)菌體的生長(zhǎng)可能存在一定的促進(jìn)作用，但使CaCl2對(duì)菌絲生長(zhǎng)起顯著性促進(jìn)作用的應(yīng)為Ca2+。具體Ca2+如何影響菌體生長(zhǎng)，有待進(jìn)一步研究。選取CaCl2為最佳無(wú)機(jī)鹽，對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L這6個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖6所示。

圖6 CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of calcium chloride concentration ongrowth of Eurotium cristatum

由圖6可以看出，CaCl2質(zhì)量濃度為0～2.5 g/L時(shí)，菌絲干質(zhì)量呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)；5 g/L時(shí)，達(dá)到最大值；在5～15 g/L時(shí)呈下降趨勢(shì)，推測(cè)原因可能為該濃度區(qū)間不利于冠突散囊菌的生長(zhǎng)繁殖，也可能為在該區(qū)間冠突散囊菌大量繁殖，但受到發(fā)酵搖瓶空間及碳氮源的制約，進(jìn)而阻礙了冠突散囊菌的生長(zhǎng)。

2.1.4 黑毛茶提取液濃度對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響

對(duì)于空白組實(shí)驗(yàn)，在未添加任何碳氮源、無(wú)機(jī)鹽的黑毛茶提取液中，冠突散囊菌依然可以生長(zhǎng)，這說(shuō)明黑毛茶提取液自身就含有一定量的糖類(lèi)和小分子氨基酸等物質(zhì)，可以為菌體生長(zhǎng)提供碳氮源等物質(zhì)，因此推測(cè)其濃度也會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。為此，黑毛茶提取液設(shè)3、6、9、12和15 g/L這5個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖7所示。

圖7 黑毛茶提取液質(zhì)量濃度對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of extraction solution concentration of raw dark tea on growth of Eurotium cristatum

從圖7可以看出，黑毛茶提取液濃度與菌體生長(zhǎng)有顯著的相關(guān)性。在3～9 g/L時(shí)，菌絲干質(zhì)量隨著提取液濃度的升高而增加；9 g/L時(shí)，達(dá)到最大值；質(zhì)量濃度高于9 g/L時(shí)，菌絲干質(zhì)量隨著濃度升高而降低。這與尹旭敏[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

通過(guò)上述培養(yǎng)基成分的一系列優(yōu)化，得到了冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵黑茶的最佳培養(yǎng)基成分及其濃度，以此作為最適培養(yǎng)基培養(yǎng)冠突散囊菌(實(shí)驗(yàn)組)，與未經(jīng)過(guò)優(yōu)化的黑毛茶提取液進(jìn)行對(duì)比(空白組)，分別研究菌體的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖8所示。

圖8 優(yōu)化前后培養(yǎng)基對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of medium before and after optimizationon growth of Eurotium cristatum

由圖8可以看出，優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)冠突散囊菌所得的菌絲干質(zhì)量是空白組的近10倍。此結(jié)果表明，通過(guò)添加碳氮源、無(wú)機(jī)鹽及調(diào)節(jié)黑毛茶提取液的濃度，冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵的效果得到了顯著提升。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

首先考察接種量對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 接種量對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of inoculum size on growth ofEurotium cristatum

由圖9可知：接種量為0.48×106～2.4×106個(gè)時(shí)，菌絲干質(zhì)量隨著接種量的增加而增加；接種量為2.4×106個(gè)時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值；接種量繼續(xù)增加時(shí)，菌絲干質(zhì)量開(kāi)始減少。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是，過(guò)大的接種量導(dǎo)致茶湯內(nèi)有限的溶氧量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿(mǎn)足冠突散囊菌的需要，從而抑了菌體的生長(zhǎng)繁殖。因此，選取的最佳接種量為2.4×106個(gè)(V(裝液量)∶V(孢子懸液)=20∶ 1)。

黑茶提取液的pH為4.5，上述所有優(yōu)化均是在自然pH下進(jìn)行。冠突散囊菌適宜在酸性條件下生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生孢子，如陳桂梅[19]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌產(chǎn)孢的最適pH為5；鄧放明[20]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌生長(zhǎng)的適宜pH為5～7。本實(shí)驗(yàn)pH優(yōu)化后的結(jié)果如圖10所示。

圖10 pH對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effect of pH on growth of Eurotium cristatum

由圖10可知：當(dāng)初始pH從3上升到4時(shí)，菌絲干質(zhì)量明顯增加； pH為4時(shí)，冠突散囊菌菌體干質(zhì)量最大；之后，菌絲干質(zhì)量隨著pH的繼續(xù)增大而逐漸減小。此結(jié)果證明，過(guò)酸、過(guò)堿的條件均會(huì)導(dǎo)致冠突散囊菌產(chǎn)生無(wú)性孢子，使得有性孢子的數(shù)量減少，進(jìn)而抑制冠突散囊菌的生長(zhǎng)繁殖[19]。因此最佳pH選定4。

在液態(tài)發(fā)酵中，溶氧量是一個(gè)重要的參數(shù)。調(diào)節(jié)溶氧量的方法有：改變裝液量、攪拌速度等。本實(shí)驗(yàn)中，筆者利用改變裝液量的方法來(lái)調(diào)節(jié)溶氧量，結(jié)果如圖11所示。

圖11 搖瓶裝液量對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.11 Effect of loaded broth volume on growth of Eurotium cristatum

由圖11可知：裝液量對(duì)菌絲干質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。裝液量為100 mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量最大，約為1.172 g/L，約是裝液量為25 mL時(shí)的1.3倍；裝液量超過(guò)100 mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量隨著裝液量的增加而減小。裝液量的不同，本質(zhì)上是溶氧量的不同。此結(jié)果說(shuō)明過(guò)高和過(guò)低的溶氧量都不利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此，選擇100 mL為最佳裝液量。

以24 h為單位，以菌絲干質(zhì)量為衡量指標(biāo)，考察最佳培養(yǎng)基中，冠突散囊菌在最優(yōu)發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)進(jìn)程曲線(xiàn),結(jié)果如圖12所示。

圖12 發(fā)酵時(shí)間對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響Fig.12 Effect of fermentation time on growth ofEurotium cristatum

由圖12可知：前48 h冠突散囊菌生長(zhǎng)快速；48～72 h，菌絲干質(zhì)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，增加量最明顯；72～168 h，菌絲干質(zhì)量持續(xù)增加；168～192 h，菌絲干質(zhì)量增加趨于平緩；192 h時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，之后便逐漸減小，這主要是因?yàn)榫w在增長(zhǎng)量達(dá)到最大值后，開(kāi)始自溶，從而使菌絲干質(zhì)量呈緩慢減少的趨勢(shì)。綜上，選擇192 h(8 d)為最適發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中理化成分的動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵過(guò)程中理化成分的動(dòng)態(tài)變化如圖13所示。

圖13 發(fā)酵過(guò)程中理化成分的動(dòng)態(tài)變化Fig.13 Changes of the physicochemical componentsduring the fermentation

由圖13可知：在前48 h內(nèi)，pH略有下降，因?yàn)樵谶@48 h內(nèi)，冠突散囊菌逐漸繁殖增多，發(fā)酵液中碳源不斷被菌體吸收利用，產(chǎn)生酸類(lèi)代謝產(chǎn)物，溶解到茶湯中，使其pH有所降低；48～120 h，pH逐步從4上升到5，產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源被分解利用，產(chǎn)生了堿性代謝產(chǎn)物；120～192 h，菌體生長(zhǎng)量達(dá)到極限，菌體開(kāi)始自溶，導(dǎo)致pH緩慢上升。

茶水浸出物含有多酚化合物、可溶性糖、水溶性果膠、水溶性維生素、游離氨基酸、咖啡堿、水溶性蛋白、無(wú)機(jī)鹽等多種物質(zhì)。茶水浸出物的成分及其含量反映了茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣[4]。從圖13還可知，在發(fā)酵過(guò)程中，水浸出物的含量隨著發(fā)酵進(jìn)程的推進(jìn)而逐漸減少，推測(cè)可能是茶湯中水浸出物主要由茶多酚和水溶性蛋白組成，這兩種物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中不斷減少，最終使水浸出物含量緩慢變少。

在發(fā)酵過(guò)程中，茶多酚的含量逐漸降低，與發(fā)酵前相比，減少了36.36%。這說(shuō)明在發(fā)酵期間，冠突散囊菌能夠?qū)⒉瓒喾臃纸獬煞肿恿扛〉奈镔|(zhì)或茶多酚能夠通過(guò)自動(dòng)氧化、酶促氧化等多種途徑轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。該結(jié)果與徐瑞瑞等[21]和黃群等[22]的結(jié)果一致。144 h后，茶多酚含量降低變緩慢，這是由于隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，底物濃度降低，氧化速度相對(duì)變緩；同時(shí)茶湯pH增加使多酚氧化酶失去最適pH條件而致其活性下降，也致茶多酚氧化速度降低，因此茶多酚含量下降速度也隨之變緩[22]。

在發(fā)酵過(guò)程中，可溶性蛋白的總含量逐漸減少。在初始24 h內(nèi)，茶湯中蛋白質(zhì)含量降低明顯；24～120 h，其含量繼續(xù)下降，但趨勢(shì)減緩；120～192 h，其下降速度又開(kāi)始加快。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵結(jié)束后水溶性蛋白減少了約53.8%，推測(cè)主要原因是茶湯中的大分子蛋白在發(fā)酵過(guò)程中一部分通過(guò)水解反應(yīng)分解成了氨基酸等小分子物質(zhì)，另一部分被菌體當(dāng)作氮源用于自身生長(zhǎng)繁殖。

在初始48 h內(nèi)，游離氨基酸的總量逐漸減少，其原因可能是氨基酸被菌體當(dāng)做氮源吸收利用，也可能是茶氨酸與茶多酚氧化產(chǎn)物發(fā)生結(jié)合而生成暗色聚合物或茶氨酸發(fā)生了其他氧化、降解和轉(zhuǎn)化反應(yīng)[22]；48 h后，游離氨基酸的含量又逐步增加，這可能是因?yàn)樵诖诉^(guò)程中，蛋白質(zhì)水解、茶多酚等被氧化分解從而釋放出游離氨基酸；對(duì)比發(fā)酵前后水溶性氨基酸的總量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的氨基酸總量是增加的。對(duì)于發(fā)酵前后氨基酸種類(lèi)的比較，如表1所示。發(fā)酵后較發(fā)酵前增加了3種，分別是絲氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸；減少了1種，為纈氨酸。

表1 發(fā)酵前后游離氨基酸類(lèi)別變化

2.4 發(fā)酵過(guò)程中功能成分的動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵過(guò)程中功能成分的動(dòng)態(tài)變化如圖14所示。由圖14可知：發(fā)酵前72 h，黃酮類(lèi)含量隨著菌體的生長(zhǎng)繁殖而逐漸減少；72 h后，其含量又逐漸增多。該結(jié)果與傅冬和[23]黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量持續(xù)減少的結(jié)果不一致，這可能是兩者采用的菌種和發(fā)酵條件不同。茯磚茶加工過(guò)程中，由于配糖化作用，糖苷一般難以分解，但在高溫高濕作用下，黃酮苷易發(fā)生水解，釋放糖基，從而降低茶湯的苦澀味。同時(shí)，黃酮類(lèi)的氧化產(chǎn)物還能與茶湯中的咖啡堿形成絡(luò)合物，從而有助于茯磚茶醇和滋味的形成[23]。冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前72 h的黃酮苷也可能基于同樣的原因?qū)е潞肯陆?。就整個(gè)發(fā)酵過(guò)程而言，相比發(fā)酵之前，發(fā)酵后的黃酮類(lèi)總量比發(fā)酵前增加了25%；后期，由于冠突散囊菌菌體數(shù)量的增長(zhǎng)，黃酮類(lèi)總量也不斷增加，由此推測(cè)冠突散囊菌自身代謝也可能產(chǎn)生一定量的黃酮類(lèi)物質(zhì)。

高品質(zhì)的黑茶發(fā)酵液應(yīng)當(dāng)色澤橙紅、明亮。茶湯的色澤變化取決于茶色素的變化。從圖14可以看出，3種茶色素在發(fā)酵過(guò)程中變化的趨勢(shì)各不相同。在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，茶褐素含量一直在增加：前72 h，增加趨勢(shì)較平緩；72 h后，增加速度大幅上升。茶紅素含量較低，隨著發(fā)酵的推進(jìn)，也呈小幅的上升趨勢(shì)。茶黃素含量一直較低，48～96 h間只有極微量的變化；96 h后，含量幾乎為零。本實(shí)驗(yàn)所用的黑毛茶為后發(fā)酵茶，在其生產(chǎn)過(guò)程中，已將大部分的茶黃素轉(zhuǎn)為茶褐素，所以茶褐素的含量比茶紅素和茶黃素要高出許多。單體兒茶素物質(zhì)的氧化、聚合和茶多酚的氧化也會(huì)導(dǎo)致茶褐素含量的增加。

圖14 發(fā)酵過(guò)程中功能成分的動(dòng)態(tài)變化Fig.14 Changes of the functional componentsduring the fermentation

茶葉中芳香物質(zhì)的組成十分復(fù)雜，其中包括碳?xì)漕?lèi)化合物、醛、醇、酮、酯類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)[15]。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的冠突散囊菌黑茶發(fā)酵液具有獨(dú)特的“菌花”香氣，與發(fā)酵前的菌液香氣截然不同。發(fā)酵前后香氣成分變化如表2所示。

表2 發(fā)酵前后香氣成分變化

注：離子化方式為EI源；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃。

由表2可知：發(fā)酵前茶湯的香氣成分有5種，除4-辛烯酸乙醚外，其余全由酯類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成；發(fā)酵后，香氣成分多達(dá)17種，比發(fā)酵前增加了12種。此處需要說(shuō)明的是本研究發(fā)酵采用的是通風(fēng)式液態(tài)搖瓶發(fā)酵，在長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過(guò)程中，芳香性成分會(huì)揮發(fā)，此處分析所得到的芳香性物質(zhì)的結(jié)果只是局部的，并不能代表冠突散囊菌發(fā)酵可能產(chǎn)生的所有芳香性物質(zhì)。即使這樣，發(fā)酵后茶湯中的揮發(fā)性成分大大增加，其中醇類(lèi)物質(zhì)占14.29%，醛類(lèi)物質(zhì)占7.14%。醇類(lèi)物質(zhì)含有溫和清雅的花香，且閾值較低，推測(cè)是使發(fā)酵后茶湯具有獨(dú)特“菌花香”的原因。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出的香氣成分與虞飛[15]和王華夫等[24]的結(jié)果相差較大，一方面可能因?yàn)榘l(fā)酵條件、發(fā)酵時(shí)間不同，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束殘留芳香性成分不同；另一方面可能是因?yàn)橄銡獬煞志哂袕?qiáng)烈的揮發(fā)性，在常溫下很不穩(wěn)定，大部分含量甚微的香氣物質(zhì)在檢測(cè)前已揮發(fā)。

3 結(jié)論

本文中，筆者用6 g/L的黑茶提取液作為發(fā)酵的初始培養(yǎng)基，研究了冠突散囊菌在黑毛茶提取液中發(fā)酵所需的最佳培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，并對(duì)發(fā)酵前后黑毛茶提取液中各成分的變化進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，冠突散囊菌液態(tài)培養(yǎng)基的最佳組成為90 g/L葡萄糖、7.5 g/L NH4Cl、5 g/L CaCl2和9 g/L黑茶提取液；最優(yōu)培養(yǎng)條件為250 mL搖瓶裝液量100 mL、接種量2.4×106個(gè)(V(裝液量)∶V(孢子懸液)=20∶ 1)、初始pH 4.0、28 ℃發(fā)酵8 d；在最佳培養(yǎng)基和最優(yōu)培養(yǎng)條件下，其菌絲干質(zhì)量是初始黑茶提取液、初始培養(yǎng)條件下的近30倍。發(fā)酵完成后，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液中的各理化成分發(fā)現(xiàn)，茶多酚含量減少了36.36%，總可溶性蛋白含量減少了53.80%，水浸出物含量減少了21.95%，總黃酮苷含量增加了14.40%，游離氨基酸含量增加了76.75%，茶褐素含量增加了5.08%，茶黃素、茶紅素發(fā)酵前后含量都較低，可溶性糖含量是發(fā)酵前的近4倍，芳香性成分增加了12種，多為酯類(lèi)和醇類(lèi)。本試驗(yàn)為后續(xù)開(kāi)發(fā)冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵飲品提供了理論依據(jù)。