程 芳，朱瀛奎，鐘 超，賈紅華，曹 飛，周 華，韋 萍,文 飛

(1．南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800; 2．上?？档囟魃锟萍加邢薰?，上海201210)

木質(zhì)素(lignin)是構(gòu)成植物細胞外壁的主要物質(zhì)，在木本植物中，其含量一般為20%～25%。木質(zhì)素對于人類可持續(xù)發(fā)展的重大貢獻在于能夠提供穩(wěn)定的、持續(xù)的有機物來源，更是可再生資源中僅有的可用于生產(chǎn)芳香類物質(zhì)的非石油資源[1]。因此，木質(zhì)素的應用前景十分廣闊，其衍生物具有多種特性，可作為分散劑、吸附劑、水泥減水劑和瀝青乳化劑等[2]。

通常情況下，組織細胞中的木質(zhì)素與半纖維素共價結(jié)合并緊密包裹著纖維素組分，這種結(jié)構(gòu)常導致分離木質(zhì)素中殘留少量半纖維素等雜質(zhì)，所以木質(zhì)素整體分離效率不高。解決木質(zhì)纖維素組分(尤其是半纖維素與木質(zhì)素)間的交互作用是實現(xiàn)各組分高效分離的重要前提。

目前，國內(nèi)外比較成熟的生物質(zhì)木質(zhì)素分離方法主要為酸法、堿法、有機溶劑法和離子液體法。酸法提取木質(zhì)素，主要通過濃酸來降解木質(zhì)纖維素中的碳水化合物，從而得到木質(zhì)素。但近年來，許多人開始利用有機酸進行木質(zhì)素提取研究，如Zhou 等[3]利用微波加熱輔助甲酸提取木質(zhì)素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該法提取的木質(zhì)素產(chǎn)量要遠遠高于油浴加熱輔助法提取的產(chǎn)量；Li等[4]利用微波輔助有機酸提取的木質(zhì)素具有很好的抗氧化性，這種木質(zhì)素在食品工業(yè)中得到廣泛的應用。堿法提取木質(zhì)素是目前工業(yè)上應用最為廣泛的提取方法[5-6]。根據(jù)生物質(zhì)原料的不同，選擇的堿也不相同，堿法提取的木質(zhì)素具有很高的工業(yè)價值。有機溶劑法提取木質(zhì)素作為一種新型低污染處理方法已被廣泛接受。如Fogarassy等[7]利用乙醇作溶劑，以NaHSO3作催化劑，在高溫下蒸煮，可將原料中的木質(zhì)素完全提??；Black等[8]利用乙醇和丙酮的復合有機溶劑，以少量酸作催化劑可以提取出高純度的木質(zhì)素。與其他溶劑相比，離子液體具有蒸汽壓低、溶解力強、熱穩(wěn)定性好和理化性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點。如Tan等[9]利用[C2mim][ABS]在 170～190 ℃、常壓、120 min的條件下處理甘蔗渣，木質(zhì)素的提取率可達93% ；Liu等[10]發(fā)現(xiàn)由膽堿陽離子和氨基酸陰離子組成的生物基離子液體對木質(zhì)素具有很好的溶解性。

在提取木質(zhì)素工藝中，不同方法及分離條件會導致木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元之間的連接鍵型和功能基團的差異，進而導致提取率的不同。如何獲得高活性木質(zhì)素提取率是研究的關鍵。

本研究中，筆者利用四甲基氫氧化銨(TMAH)提取小麥秸稈木質(zhì)素，用凝膠滲透色譜儀(GPC)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、紫外可見光譜(UV-Vis)和核磁共振氫譜分析(1H NMR)對木質(zhì)素進行結(jié)構(gòu)表征和理化特性分析，對TMAH濃度、溫度、時間以及固液比對小麥秸稈木質(zhì)素提取率影響的關鍵因素進行優(yōu)化，以提高小麥秸稈中木質(zhì)素總脫除率，以期為小麥秸稈木質(zhì)素應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 原料與設備

小麥秸稈原料，河南省鄭州市中牟縣官渡鎮(zhèn)宋莊，清洗烘干后用粉碎機粉碎。標準堿木質(zhì)素，山東高唐利亞科技有限公司；四甲基氫氧化銨(TMAH，250 g/L水溶液)，阿拉丁試劑公司；其他試劑為市售化學純或分析純。

Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；AVANCE III HD型核磁共振譜儀，美國Bruker公司；Genesys 10S型紫外可見(UV-Vis)分光光度計，美國Thermo公司；HLC-8320GPC型凝膠滲透色譜儀，東曹上海科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小麥秸稈化學組成分析

將清洗過的小麥秸稈于烘箱中干燥，粉碎過篩(粒徑0.85 mm)，取20 g小麥秸稈原料，按照美國國家可再生能源實驗室的測定方法[11]，測定小麥秸稈的化學組分。

1.2.2 小麥秸稈木質(zhì)素的分離工藝

取適量已烘干的小麥秸稈原料，放入燒瓶中，加入一定濃度的TMAH水溶液，水浴加熱，然后趁熱真空抽濾，濾液倒入燒杯中，加入6 mol/L的乙酸調(diào)pH至5.5，減壓濃縮，濃縮液用3倍其體積的95%乙醇處理后靜置，待沉淀完全后過濾，濾液濃縮除去乙醇后加入鹽酸攪拌，調(diào)節(jié)pH至3左右，約70 ℃保溫凝集，靜置過夜，傾倒出燒杯中的上層清液，再離心分離，然后水洗3次，冷凍干燥，所得產(chǎn)品為小麥秸稈木質(zhì)素。

1.2.3 正交試驗優(yōu)化工藝條件

在單因素試驗的基礎上，以木質(zhì)素提取率為指標，選取TMAH濃度、固液比、時間和溫度這4個因素進行正交試驗優(yōu)化，試驗因素和水平見表1。

1.2.4 TMAH水溶液的循環(huán)使用性分析

四甲基氫氧化銨的循環(huán)性研究是在木質(zhì)素提取單因素實驗所得最優(yōu)化條件下進行的。在木質(zhì)素提取過程中，所收集的所有濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.1 MPa、48 ℃條件下對濾液進行減壓濃縮，通過蒸發(fā)濃縮可獲得高濃度的TMAH水溶液，并以此配制250 g/L的溶液用于下一輪的木質(zhì)素分離提取的溶劑。在循環(huán)實驗中，TMAH水溶液的濃度利用高效液相色譜進行檢測，并以此計算溶劑回收率。

1.3 小麥秸稈木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 木質(zhì)素分子量測定

分離木質(zhì)素分子量的測定采用凝膠滲透色譜儀(GPC)進行分析，色譜柱采用PL gel 10 μm MIXED-B(安捷倫科技(中國)有限公司)。準確稱取4.0 mg乙?；举|(zhì)素樣品溶解在2 mL色譜四氫呋喃(THF)中，溶解后液體采用0.45 μm濾頭過濾進色譜柱進行分析[12]，進樣量為50 μL。

1.3.2 紫外可見光譜(UV-Vis)測定

采用UV-Vis分光光度計測定。按照固液比為1∶ 20 g/mL，將分離木質(zhì)素和標準木質(zhì)素樣品溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制成樣品溶液，隨后將1 mL待測溶液加入1 cm光徑的石英比色皿中，利用紫外分光光度計對溶液進行全波長掃描，以二甲基亞砜作為參比液，比較2種樣品的特征吸收峰位置，掃描范圍200～350 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定。分離物質(zhì)和標準木質(zhì)素樣品干燥研磨后用KBr壓片(m(木質(zhì)素)∶m(KBr)=1∶ 100)，KBr做背景掃描；分辨率為4 cm-1，掃描范圍為3 750～750 cm-1；掃描次數(shù)32次。

1.3.4 核磁共振氫譜(1H NMR)分析

以CDCl3為溶劑配制質(zhì)量濃度為20 g/L的乙?；举|(zhì)素溶液，其中乙酰化木質(zhì)素是參照文獻[13]中的方法制備，將待測溶液加入5 mm核磁檢測管，以四甲基硅烷(TMS)做內(nèi)標，通過核磁共振譜儀進行1H NMR檢測。豫馳時間1.5 s，采樣時間0.17 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥秸稈化學組成分析結(jié)果

小麥秸稈化學組成分析結(jié)果見表2。由表2可知：小麥秸稈中纖維素和半纖維素為主要成分，但木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)為14.8%。

表2 小麥秸稈的化學組分(絕干原料)

2.2 木質(zhì)素提取的單因素試驗

2.2.1 溫度對木質(zhì)素提取率的影響

溫度是控制化學反應速率和方向的重要因素。在TMAH質(zhì)量濃度為250 g/L、時間14 h、固液比為1∶ 14 g/mL的條件下，考察溫度對木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對木質(zhì)素提取率影響Fig.1 Effect of temperature on the yield of isolated lignin

由圖1可知：當溫度為50 ℃時，木質(zhì)素的提取率為77.4%，適當?shù)厣郎赜欣谄茐哪举|(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是溫度過高，木質(zhì)素的提取率反而越低。可能是由于高溫時大量纖維素溶解，從而影響了木質(zhì)素的溶出。通過對過濾剩余的秸稈進行檢測，發(fā)現(xiàn)秸稈中有15%左右的木質(zhì)素未被提取出來，因此溫度在50 ℃時為宜。

2.2.2 時間對木質(zhì)素提取率的影響

在溫度50 ℃、TMAH質(zhì)量濃度250 g/L、固液比為1∶ 14 g/mL時，考察時間對木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 時間對木質(zhì)素提取率影響Fig.2 Effect of time on the yield of isolated lignin

由圖2可知：木質(zhì)素的提取率隨著時間的增加而增加，當時間為14 h時，木質(zhì)素的提取率為77.5%，隨著時間的增加，趨于平緩，提取基本結(jié)束。

研究發(fā)現(xiàn)，TMAH水溶液處理秸稈時間過短，提取的產(chǎn)物中木質(zhì)素的純度較低，處理時間越長木質(zhì)素的純度越高?？赡苁怯捎诙虝r間地處理木質(zhì)素未完全溶出而較長的TMAH處理時間有利于小麥秸稈木質(zhì)素的溶出，因此時間以14 h為宜。

2.2.3 固液比對木質(zhì)素提取率的影響

在溫度50 ℃、時間14 h、TMAH質(zhì)量濃度為250 g/L的條件下，考察固液比對小麥秸稈中木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 固液比對木質(zhì)素提取率的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio onthe yield of isolated lignin

由圖3可知，當固液比為1∶ 14 g/mL時，木質(zhì)素的提取率為79.9%。研究發(fā)現(xiàn)，過量的季銨堿溶液處理秸稈，提取得到的產(chǎn)物木質(zhì)素純度也較低，可能是由于過量的季銨堿溶液的處理使纖維組分發(fā)生溶解而影響了木質(zhì)素的提取，因此木質(zhì)素提取的固液比1∶ 14 g/mL為宜。

2.2.4 TMAH濃度對木質(zhì)素提取率的影響

木質(zhì)素通過酯鍵與半纖維素連接，經(jīng)過TMAH水溶液預處理將酯鏈斷裂，從而實現(xiàn)木質(zhì)素的分離。在溫度50 ℃、時間14 h、固液比為1∶ 14g/mL的條件下，考察TMAH質(zhì)量濃度對小麥秸稈中木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 TMAH濃度對木質(zhì)素提取率的影響Fig.4 Effect of TMAH concentration on theyield of isolated lignin

由圖4可知，木質(zhì)素的提取率隨著TMAH質(zhì)量濃度的增加而增加，TMAH質(zhì)量濃度為240 g/L時，木質(zhì)素的提取率為78.9%，使用低濃度的季銨堿溶液可以避免在處理過程中纖維組分發(fā)生溶解。因此，TMAH質(zhì)量濃度240 g/L為宜。

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗法篩選提取工藝

通過9種試驗方案分離得到木質(zhì)素干制品，利用Klason木質(zhì)素法測分離木質(zhì)素的純度，計算木質(zhì)素的提取率，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 L9(34)正交試驗結(jié)果

表4 方差分析表

由表3分析可知，四甲基氫氧化銨提取小麥秸稈木質(zhì)素影響因素為B、A、C、D，最佳工藝組合是A2B2C3D2，即提取溫度50 ℃、提取時間14 h、固液比1∶ 14 g/mL、TMAH質(zhì)量濃度250 g/L。在最佳工藝條件下的木質(zhì)素提取的驗證試驗得到的小麥秸稈木質(zhì)素的提取率為79.9%。

2.3.2 TMAH水溶液的回收利用

四甲基氫氧化銨在木質(zhì)素分離提取過程中的循環(huán)性實驗結(jié)果如表5所示。

由表5可知，隨著溶劑循環(huán)次數(shù)的增加，木質(zhì)素的分離效率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，經(jīng)過5次循環(huán)使用，溶劑回收率保持在85%以上，分離木質(zhì)素純度比第一輪分離物質(zhì)降低了17%，這可能是由于多次循環(huán)使用造成溶劑中的雜質(zhì)(芳香類物質(zhì)、纖維糖等)逐漸積累，使得部分OH-發(fā)生鈍化所致。同時，再生過程中的溶劑分解以及操作導致的溶劑損失都將會影響溶劑的循環(huán)使用性能。本研究利用四甲基氫氧化銨提取小麥秸稈木質(zhì)素條件溫和，木質(zhì)素提取率和純度均較高，避免了傳統(tǒng)方法對原料中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)影響及木質(zhì)素的溶出損失。

表5 木質(zhì)素分離提取中TMAH循環(huán)使用

2.4 木質(zhì)素結(jié)構(gòu)表征結(jié)果分析

2.4.1 分子量分布

為了表征季銨堿分離得到的堿木質(zhì)素的分子量的特點，采用凝膠滲透色譜法(GPC)對分離得到的木質(zhì)素組分的分子量進行分析，結(jié)果見圖5。木質(zhì)素組分的重均分子量(Mw)和數(shù)均分子(Mn)和多分散性指數(shù)(Mw/Mn,表征分子量分布的寬度)。

由圖5可以發(fā)現(xiàn)，四甲基氫氧化銨分離得到的木質(zhì)素樣品的分子量為1 420 g/mol，比麥草秸稈原料提取的磨木木質(zhì)素分子量(7 500 g/mol)低[14]，說明季銨堿提取小麥木質(zhì)素會使木質(zhì)素發(fā)生降解，體系中獲得的相對高得率和高純度的木質(zhì)素為低聚片段。

多分散系數(shù)Mw/Mn表示分子量的均一程度，分散系數(shù)越小，表示提取的木質(zhì)素分子比較均一。值得注意的是，此方法得到的木質(zhì)素分子的多分散系數(shù)很小(接近1.0)，說明季銨堿提取的小麥秸稈木質(zhì)素分子量分布均一，有利于對其進行加工利用。

圖5 分離木質(zhì)素的分子量分布Fig.5 GPC curve of the isolated lignin

2.4.2 紅外光譜(FT-IR)分析結(jié)果

采用紅外光譜對分離物質(zhì)及標準堿性木質(zhì)素樣品進行紅外光譜分析，結(jié)果見圖6。

圖6 標準木質(zhì)素及分離木質(zhì)素FT-IR紅外光譜圖Fig.6 FT-IR analysis of the standard ligninand isolated lignin

2.4.3 紫外可見光譜(UV-Vis)分析結(jié)果

通過對分離物質(zhì)和標準木質(zhì)素的紫外光譜分析，結(jié)果見圖7。

圖7 標準木質(zhì)素及分離木質(zhì)素紫外光譜圖Fig.7 UV analyses of the standard ligninand isolated lignin

由圖7可知：2種物質(zhì)展現(xiàn)的紫外吸收特征峰的位置基本相同，波長在280～290 nm以及260 nm處均出現(xiàn)明顯的吸收峰[17]，其中波長位于280～290 nm的吸收峰源于木質(zhì)素中的非共軛酚羥基(即典型愈創(chuàng)木基G)；而波長在260 nm處的吸收峰則為木質(zhì)素苯環(huán)的特征吸收峰，這兩處吸收峰均為木質(zhì)素的特征紫外吸收峰。同時，分離物質(zhì)與標準木質(zhì)素的吸收峰強度也極為接近，間接表明分離物質(zhì)中含有高純度的木質(zhì)素組分，雜質(zhì)含量較少；同時也表明分離再生過程中木質(zhì)素功能結(jié)構(gòu)保持較為完整[18]。

2.4.4 核磁共振氫譜(1H NMR)分析結(jié)果

為了進一步探究分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)官能團性質(zhì)，研究以CDCl3為溶劑對分離物質(zhì)進行1HNMR檢測，結(jié)果見圖8。

結(jié)合文獻[19]和圖5分析可知：δ=8.0～6.1的信號能直接提供木質(zhì)素芳環(huán)的取代信息，δ=7.40～8.00處是對羥苯基的質(zhì)子信號。其中化學位移δ=7.26 處的強峰源于溶劑CDCl3的吸收信號，δ=6.70～7.40是愈創(chuàng)木基的質(zhì)子信號。通過1H NMR圖譜還能看出，δ=3.75處的峰較強，該信號是由甲氧基中的H原子產(chǎn)生的信號，屬于分離物中芳香環(huán)上的甲氧基；δ=2.0～2.5 處的強峰為木質(zhì)素羥基中H原子產(chǎn)生的信號，δ=0.8～2.0為脂肪族上的質(zhì)子信號。結(jié)果表明提取木質(zhì)素基本保持完整的木質(zhì)素功能結(jié)構(gòu)。

圖8 分離木質(zhì)素的1H NMR分析圖譜Fig.8 1H NMR analysis of the isolated lignin

3 結(jié)論

利用季銨堿溶劑對生物質(zhì)原料木質(zhì)素進行分離提取，并對分離木質(zhì)素進行結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗得到最佳提取優(yōu)化條件：TMAH質(zhì)量濃度250 g/L 、時間14 h、溫度50 ℃，固液比1∶ 14(g/mL)，木質(zhì)素的提取率達到79.9%。

通過紅外光譜分析及核磁氫譜分析結(jié)果可知，分離木質(zhì)素含有H-G-S型木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特征。紫外可見光譜分析發(fā)現(xiàn)分離木質(zhì)素在波長280～290 nm以及260 nm處均出現(xiàn)明顯的吸收峰，其中280～290 nm的吸收峰源于木質(zhì)素中的非共軛酚羥基(即典型愈創(chuàng)木基G)，而波長在260 nm處的吸收峰則為木質(zhì)素苯環(huán)的特征吸收峰，說明分離再生過程中木質(zhì)素功能結(jié)構(gòu)保持較為完整。

本研究利用低濃度的季銨堿溶劑對生物質(zhì)原料進行處理，可以實現(xiàn)木質(zhì)素組分的高效分離，所分離的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)保持較為完整，這將為木質(zhì)素利用技術(shù)的開發(fā)提供新的思路。