董一 萬(wàn)光明 閆磐石 錢誠(chéng) 梁申芝 王炯

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最嚴(yán)重也是最常見的眼部并發(fā)癥，致盲率極高，被普遍認(rèn)為是四大致盲因素之一[1]。其發(fā)病原因復(fù)雜，是多因素影響的、多階段共同作用的病理過程[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元凋亡與DR有密切聯(lián)系[5]。目前，糖尿病的高血糖通過何種途徑導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生DR的機(jī)制尚不明確，DR的防治仍是相關(guān)研究領(lǐng)域的重要課題。本研究擬通過探討DR神經(jīng)元凋亡及醛糖還原酶和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體對(duì)其的影響，解析DR的具體發(fā)病機(jī)制，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選擇健康清潔級(jí)Wistar大鼠36只，雄性，10周齡，體質(zhì)量170～230(200±30)g，購(gòu)自上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、轉(zhuǎn)染組，每組各12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循ARVO聲明。

1.1.2 模型建立方法轉(zhuǎn)染組和模型組大鼠采用一次性左下腹腔內(nèi)注射5 mL鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型[6]，對(duì)照組注射PBS緩沖液。構(gòu)建含有晚期糖基化終末產(chǎn)物受體siRNA的質(zhì)粒(siRNA的設(shè)計(jì)和質(zhì)粒的構(gòu)建均由上海藍(lán)基生物科技有限公司完成)，于造模后第2天利用慢病毒轉(zhuǎn)染入轉(zhuǎn)染組大鼠體內(nèi)。轉(zhuǎn)染操作：按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說(shuō)明，將DNA與Lipofectamine2000混勻后室溫下靜置20 min，將1 mL混合液以鼠尾靜脈注射方式共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 空腹血糖和大鼠體質(zhì)量測(cè)定造模后4周、8周、12周，稱大鼠體質(zhì)量后禁食6 h，剪尾取血后采用血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)測(cè)定各組大鼠的空腹血糖。

1.2.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)造模后9周，禁食6 h，各組大鼠均使用0.2 g·mL-1·kg-1體質(zhì)量葡萄糖(華仁藥業(yè)股份有限公司)灌胃[7]。分別于灌胃后30 min、60 min、90 min、120 min剪尾取血檢測(cè)血糖。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡情況按試劑盒說(shuō)明書(上海碧云天公司)操作，采用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡情況。造模后12周，每組隨機(jī)選取3只大鼠斷頸處死，取雙眼眼球，采用40 g·L-1多聚甲醛固定1 h后，使用體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液和預(yù)冷處理的蛋白酶K(20 mg·L-1，pH為7.4～8.0)處理，然后于37 ℃濕盒dUTP標(biāo)記2 h。SABC鏈霉親和素-過氧化物酶結(jié)合，DAB顯色。染色后，細(xì)胞核呈棕黃色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)是指每張TUNEL陽(yáng)性切片5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者)最多的高倍視野(×400)中陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比。

1.2.4 醛糖還原酶的測(cè)定造模后12周，每組隨機(jī)選取3只大鼠斷頸處死。取雙眼晶狀體，采用KH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.0，含120 mmol ·L-1的Li2SO4；上海碧云天公司)提取醛糖還原酶，熒光分光光度計(jì)測(cè)定酶活性[8]。

1.2.5 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的測(cè)定造模后12周，每組隨機(jī)選取3只大鼠斷頸處死。取雙眼眼球，分離出視網(wǎng)膜組織，離心取上清液，參考文獻(xiàn)[9]的方法提取上清液用于晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的測(cè)定。采用Western blotting法測(cè)定晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的表達(dá)，80 g·L-1分離膠與50 g·L-1濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，與兔抗大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物受體多克隆抗體(1200稀釋)和羊抗兔IgG抗體(11000稀釋)結(jié)合。采用魯米諾試劑進(jìn)行發(fā)光顯色后，確定晚期糖基化終末產(chǎn)物受體相對(duì)GAPDH的表達(dá)量。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)造模后12周，將每組剩余3只大鼠斷頸處死，取雙眼眼球，分離出視網(wǎng)膜組織。取80 mg受試大鼠視網(wǎng)膜組織用液氮研碎，加1 mL Trizol制成勻漿。再加入0.2 mL氯仿后混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。加0.5 mL異丙醇后，4 ℃12 000 r·min-1離心10 min。棄去上清液，加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇清洗一次。真空干燥后，用DEPC處理過的雙蒸水溶解沉淀，即得RNA樣品。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，加入引物后進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后采用20 g ·L-1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)條帶的積分光密度值，計(jì)算得到Bcl-2和Bax相對(duì)β-actin mRNA的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量造模前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=4.156)。造模后與造模前相比，各組大鼠體質(zhì)量均明顯增加(均為P<0.05)，且造模后8周體質(zhì)量高于造模后4周(均為P<0.05)。造模后4周和8周，轉(zhuǎn)染組和模型組的大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組(均為P<0.05)，但兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。造模后12周，轉(zhuǎn)染組和模型組的大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組(均為P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的體質(zhì)量

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.2 各組大鼠空腹血糖水平比較造模后4周、8周、12周，各組內(nèi)大鼠空腹血糖水平均無(wú)明顯變化(均為P>0.05)。造模后4周、8周、12周，轉(zhuǎn)染組和模型組大鼠的空腹血糖水平均高于對(duì)照組(均為P<0.05)，但兩組間空腹血糖差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠的空腹血糖水平

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M和轉(zhuǎn)染組大鼠在口服葡萄糖后30 min時(shí)，血糖水平均高于對(duì)照組，且轉(zhuǎn)染組更高(均為P<0.05)。隨著時(shí)間推移，模型組和轉(zhuǎn)染組大鼠的血糖水平在120 min時(shí)下降至最低，但仍高于對(duì)照組(均為P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組仍高于模型組(P<0.05)。見表3。

2.4 視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡情況模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡指數(shù)為(64.85±9.82)%，轉(zhuǎn)染組為(89.37±8.37)%，均高于對(duì)照組的(5.02±0.34)%(均為P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組高于模型組(P<0.05)。

2.5 醛糖還原酶和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體測(cè)定模型組和轉(zhuǎn)染組大鼠的醛糖還原酶活性和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體均高于對(duì)照組(均為P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組高于模型組(均為P<0.05)。見表4。

表3 各組大鼠的口服葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

表4 各組大鼠的醛糖還原酶活性和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.6 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)模型組和轉(zhuǎn)染組的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(均為P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組低于模型組(P<0.05)。模型組和轉(zhuǎn)染組的Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(均為P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組高于模型組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜中Bcl-2和Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

3 討論

一般認(rèn)為，在高血糖的環(huán)境下，氧自由基損傷和晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成、積累是影響細(xì)胞正常生理功能的重要原因[10]。凋亡相關(guān)基因分為凋亡促進(jìn)基因和凋亡抑制基因兩種。其中，Bcl-2是最主要的抑制基因，其可阻止細(xì)胞凋亡。Bax是Bcl的同源基因，它的表達(dá)可以抑制Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡[11]。DR的發(fā)病原因復(fù)雜，是多因素影響的、多階段共同作用的病理過程。在高血糖的環(huán)境下，通過氧自由基損傷和晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成、積累影響細(xì)胞的正常生理功能[12]。但是其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，DR的防治仍是相關(guān)領(lǐng)域的重要研究課題。晚期糖基化終末產(chǎn)物是過量的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物。研究表明，持續(xù)高血糖引起體內(nèi)多種蛋白質(zhì)非酶糖基化及由此形成的晚期糖基化終末產(chǎn)物在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和轉(zhuǎn)染組大鼠在口服葡萄糖30 min后血糖水平顯著高于對(duì)照組；模型組和轉(zhuǎn)染組大鼠的血糖水平在120 min時(shí)下降至最低，但仍高于對(duì)照組。模型組和轉(zhuǎn)染組的視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡指數(shù)、醛糖還原酶活性、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體和Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，尤其轉(zhuǎn)染組高于模型組；模型組和轉(zhuǎn)染組的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組亦低于模型組。以上結(jié)果說(shuō)明，在糖尿病的作用下，長(zhǎng)時(shí)間的高血糖導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生，與文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致。晚期糖基化終末產(chǎn)物會(huì)直接損傷細(xì)胞，引起自由基增加[16]。晚期糖基化終末產(chǎn)物與其受體結(jié)合后，也會(huì)誘導(dǎo)大量氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量氧自由基。自由基會(huì)破壞細(xì)胞線粒體正常結(jié)構(gòu)，干擾其氧化磷酸化功能，抑制了ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而削弱了鈣/鈉等泵功能，從而引起鈣內(nèi)流[17]。以上損傷導(dǎo)致抑制因子Bcl-2表達(dá)量的降低和Bax表達(dá)量的升高，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致DR[18]。

本研究結(jié)果表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物結(jié)合受體后，產(chǎn)生大量的氧自由基損傷可能是導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致DR的直接或間接的最后共同通路。該機(jī)制的揭示為DR的預(yù)防提供了理論依據(jù)，有極其重要的意義。