劉欣欣 盧愛東 王亞星 魏文斌 陳朔華 吳壽嶺

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是含有細胞毒性的一種含硫氨基酸，是蛋氨酸脫甲基過程中產生的中間代謝產物。近期有研究提出，升高的Hcy水平是冠心病(coronary heart disease，CHD)等心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)死亡的獨立危險因子[1]。高Hcy水平除了被廣泛用作CVD的預測因子外，有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy和非心臟血管疾病之間的關系同樣密切，高Hcy血癥與顱內動脈粥樣硬化性狹窄有關，與中風、外周動脈疾病、頸動脈疾病、慢性腎臟疾病、動脈粥樣硬化性腎動脈狹窄、腹主動脈瘤和勃起功能障礙均相關[2]。既往對Hcy在眼內血管性病變中的作用和影響方面研究發(fā)現(xiàn)，高Hcy在年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞的發(fā)病過程中均扮演了重要的角色[3-5]，但這些研究多局限在已發(fā)病患者的眼內局部組織的生理改變，血漿中Hcy水平和大型人群中的眼內血管變化情況的關系卻少有研究報道。

在流行病學調查中，多利用眼底彩色照相技術對視網膜血管進行定性觀察和定量測量，從而對其與心腦血管疾病的關系進行研究。研究表明，視網膜微血管的改變可以用作觀測和指示指標對全身微血管病變的臨床前期進行評估[6]。然而，對于血漿內Hcy水平和視網膜微血管改變的研究尚少。本研究將從流行病學方向，采用計算機分析軟件及國際標準公式對視網膜血管直徑進行定量測量，從而對血漿內Hcy水平與視網膜微血管改變間的關系進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料開灤研究(注冊號：ChiCTR-TNC-11001489)中2012-2013年參加健康體檢(年齡≥40歲)并自愿行眼部檢查并行眼底彩色照相的人群。開灤研究是基于河北省唐山市開灤社區(qū)對開灤集團在職及離退休員工進行健康體檢并隨訪的前瞻性隊列研究。人群來源：2006年6月至2007年10月和2008年6月至2009年10月由開灤總醫(yī)院等11家醫(yī)院對開灤集團在職及離退休職工分別進行2次健康體檢。2009年12月由首都醫(yī)科大學附屬天壇醫(yī)院腦卒中臨床試驗和研究中心人員，在上述健康體檢職工中按2005年全國1%人口抽樣調查所得的40歲以上全國人口性別和年齡的比例[7]，根據每2歲一個年齡段按比例分層隨機抽取開灤集團職工作為觀察人群，并于每2 a一次對觀察人群進行體檢。本課題采用的是2012-2013年的橫斷面人群資料。

1.2 納入標準和排除標準納入標準：(1)年齡≥40歲；(2)種族、年齡不限；(3)無認知能力障礙，可完成調查問卷者；(4)同意參加此研究并且簽署知情同意書者。排除標準：(1)既往史有缺血性腦卒中、腦出血、蛛網膜下腔出血病史者；(2)既往有心肌梗死病史者；(3)未能完成眼底彩照檢查者或采集眼底照片質量不符合軟件分析要求者。

1.3 流行病學調查、人體測量指標和生化指標檢測開灤隊列研究均采用一致性的流行病學調查問卷及人體測量指標和生化指標檢測，可見本課題組已發(fā)表文獻[8-9]，其中本研究的調查員及體檢醫(yī)師均為固定人員且經過統(tǒng)一培訓。血壓測量方法：受試對象于體檢當天上午測量前30 min內禁止吸煙或飲茶、咖啡，背靠靜坐15 min后進行血壓測量。應用經校正的汞柱式血壓計來測量受試者右側肱動脈血壓，連續(xù)測量3次，結果取均值。吸煙的定義為受試者每天至少吸一支煙，至少持續(xù)1 a以上；飲酒的定義為受試者每天平均飲白酒(酒精含量50%以上)100 mL，至少持續(xù)1 a以上。測量身高(精確到 1 mm)和體質量(精確到0.1 kg)，計算其BMI(kg·m-2)。于體檢當天上午700-900抽取受試者空腹肘靜脈血5 mL，分離并提取血清，用于生化測量指標的檢測。生化指標包括：空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、高敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)及Hcy等。所有受試者血清統(tǒng)一用日立7600自動生化分析儀檢測，并由同一組專業(yè)檢驗醫(yī)師進行操作。Hcy采用免疫比濁法測定，試劑盒由北京九強生物技術有限公司提供，操作過程嚴格按照試劑說明書進行，隨批質控。

1.4 視網膜血管直徑的測量由熟練的眼科技師操作免散瞳眼底彩色照相儀(Type CR6-45NM；Canon，Ota，Tokyo，Japan)拍攝受試者的彩色眼底照(45°)，分別以其雙眼視盤和黃斑為中心進行照片采集。均選用受試者右眼彩色眼底照片，利用計算機分析軟件(IVAN；University of Wisconsin，Madison，WI)測量眼底距離視盤邊緣0.5～1.0 PD的6條較大的視網膜分支動脈和靜脈直徑，使用 Knudtson-Parr-Hubbard 公式[10]計算下列參數(shù)：視網膜中央動脈直徑(central retinal artery equivalent，CRAE)、視網膜中央靜脈直徑(central retinal vein equivalent，CRVE) 和視網膜動靜脈比(arteriovenous ratio，AVR)。

2 結果

2.1 一般情況2012-2013年行全身及眼部檢查的查體人群(年齡≥40歲)共3447人，其中男1936人。排除輸入錯誤導致血管極值26人，未進行Hcy檢查的人數(shù)20人，納入本研究統(tǒng)計分析人群3401人，男1910人、女1491人。研究對象年齡為(56.81±10.17)歲，Hcy為0.09～70.60(15.27±9.11)mmol·L-1，其中CRAE為(174.29±24.59)μm、CRVE為(281.74±28.66)μm、AVR為0.62±0.11。將Hcy按四分位分組(Hcy四分位數(shù)分別為9.50 mmol·L-1、13.30 mmol·L-1、18.20 mmol·L-1)，體檢人群的相關因素測量值見表1。

表1 所有觀察對象的基線情況

注：SBP：收縮壓；1 kPa=7.5 mmHg

2.2 Hcy與CRAE、CRVE、AVR間相關性分析Spearman相關分析顯示，Hcy與CRAE呈負相關(r=-0.125，P<0.001)，與CRVE呈負相關(r=-0.093，P<0.001)，Hcy與AVR也呈負相關(r=-0.050，P=0.004)

2.3 影響CRAE、CRVE、AVR的多因素線性回歸分析模型1分別以CRAE、CRVE和AVR作為因變量，Hcy測量值作為自變量，采用線性回歸分析Hcy對CRAE、CRVE和AVR的影響，結果顯示，Hcy是CRAE(β=-0.292，P<0.001)、CRVE(β=-0.241，P<0.001)和AVR(β=-0.001，P=0.003)的影響因素。模型2在模型1的基礎上校正了年齡、性別，結果顯示，Hcy是CRAE(β=-0.101，P=0.034)和CRVE(β=-0.142，P=0.004)的影響因素，對AVR的影響不具有相關性。在考慮了全身各因素的共線性后，模型3在模型2的基礎上進一步校正了BMI、SBP、FBG、LDL-C、HDL-C、hsCRP、吸煙、飲酒后，結果顯示，Hcy仍是CRAE(β=-0.120，P=0.020)和CRVE(β=-0.147，P=0.006)的危險因素，即Hcy每增加一個單位，CRAE下降幅度為0.120 μm，CRVE下降幅度為0.147 μm；同時可見，年齡和SBP是CRAE的危險因素，性別是CRAE的保護因素；年齡、HDL-C、LDL-C和hsCRP均是CRVE的危險因素；BMI、收縮壓是AVR的危險因素，性別則是保護因素。見表2、表3和表4。

表2 影響CRAE的多因素線性回歸分析

注：a調整R2=0.012；b調整R2=0.070；c調整R2=0.087

表3 影響CRVE的多因素線性回歸分析

注：a調整R2=0.007；b調整R2=0.053；c調整R2=0.061

表4 影響AVR的多因素線性回歸分析

注：a調整R2=0.002；b調整R2=0.014；c調整R2=0.042

2.4 影響AVR的多因素Logistic回歸分析正常AVR約為2/3，故將AVR<0.67及≥0.67分為兩組，模型以AVR分組為因變量，以Hcy四分位分組為自變量，同時校正多種因素，以第一分位組為對照，采用Logistic回歸分析Hcy對AVR分組的影響，結果顯示，同第一分位組相比，第二分位組、第三分位組、第四分位組均不是AVR的危險因素(均為P>0.05)，OR值分別為0.985(95%CI為0.757～1.283)、1.094(95%CI為0.851～1.407)和1.046(95%CI為0.815～1.343)。見表5。

表5 影響AVR的多因素Logistic回歸分析

2.5 性別分層計算影響CRAE、CRVE、AVR的多因素線性回歸分析因為性別與Hcy存在交互作用，故而將性別進一步分層，分別以CRAE、CRVE和AVR作為因變量，Hcy測量值作為自變量，同時校正多種因素后，采用線性回歸分析在性別分層情況下Hcy對CRAE、CRVE和AVR的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在男性中，Hcy是CRAE(β=-0.132，P=0.035)和CRVE (β=-0.136，P=0.048)的危險因素，在女性中，Hcy對CRAE和CRVE的影響無統(tǒng)計學意義；Hcy與AVR在男女人群中均未見有統(tǒng)計學意義的明顯影響。

3 討論

Hcy是各種CVD的危險因素，可以影響血管內皮產生的NO生物利用度，從而加重氧化應激反應，導致內皮功能障礙的危險性增加，內皮細胞凋亡,進而形成慢性炎癥、血栓形成，造成血管管腔狹小及粥樣硬化[11]。視網膜微血管與腦部微血管在形態(tài)和生理上具有很多相同特性，被證實與體內心臟、肺臟和腦部的微血管具有同源結構[12]。有研究發(fā)現(xiàn),視網膜血管微循環(huán)結構的改變與心腦微循環(huán)疾病，如高血壓[13]、動脈粥樣硬化、中風、阿爾茲海默等疾病有密切相關性，是心腦血管事件重要的觀測因子。同時，視網膜血管直徑在其他全身性血管性疾病中，如精索靜脈曲張和腎臟疾病中也被發(fā)現(xiàn)有明顯的改變和評估作用[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy與CRAE(r=-0.125，P<0.001)、CRVE(r=-0.093，P<0.001)和AVR(r=-0.050，P=0.004)均有相關性。將Hcy分別和CRAE、CRVE和AVR進行多因素線性回歸分析，結果顯示，Hcy是CRAE(β=-0.292)和CRVE(β=-0.241)的危險因素(均為P<0.05)，在逐步校正了心腦血管多種混雜因素后，這種影響關系仍然存在(CRAE：β=-0.120，CRVE：β=-0.147，均為P<0.05)。而在矯正了心腦危險因素后，Hcy對AVR的影響則無統(tǒng)計學意義，我們分析可能原因為AVR為CRAE與CRVE的比值，在CRAE和CRVE的值同時隨著Hcy的增加而減小的時候，幅度相近，比值變化不明顯，進一步將AVR轉化為分類變量進行回歸分析，發(fā)現(xiàn)Hcy并不是AVR的危險因素，即隨著血漿中Hcy的含量增加，視網膜血管的動靜脈直徑均呈減小的趨勢，且趨勢相近，AVR未見影響。這與既往研究不盡相同，Gopinath等[15]在Blue Mountains Eye Study對2334名(≥49歲)人群進行研究發(fā)現(xiàn)，整體人群中Hcy和血管直徑未見關聯(lián)，而Hecke等[16]在Hoorn Study對256名(年齡60～85歲)人群進行研究，在矯正了年齡、性別和糖耐量后發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy增高CRAE出現(xiàn)和CRVE均減小，但是只有CRAE的關聯(lián)有統(tǒng)計學意義。

Omae等[17]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激和明顯的蛋白激酶信號通路均參與Hcy介導的效應，Hcy通過介導與P38激酶相關的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NAD(P)H oxidase)產生過氧化物，從而影響依賴NO介導的血管內皮反應，導致視網膜小動脈擴張，或許可以從生理學角度解釋本研究中隨著Hcy的增高、CRAE減小的現(xiàn)象。同時如前所述，在既往的心腦血管研究中發(fā)現(xiàn)，Hcy影響依賴于NO的血管內皮，可以造成血管的管腔狹窄，眼底血管與心腦血管具有同源結構。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy的增高，CRVE減小，推測視網膜小靜脈發(fā)生了和心腦等全身血管相同的生理反應。

我們的研究在帶入心腦血管因素行多因素分析發(fā)現(xiàn)，CRAE與年齡、性別和血壓的關系亦有統(tǒng)計學意義，CRVE與年齡、HDL-C、LDL-C和CRP的關系亦有統(tǒng)計學意義，這與既往研究大致相同[16]。我們將性別進一步分層發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy的增高，CRAE和CRVE減小的現(xiàn)象只存在于男性而不是女性人群，Gopinath等[15]將性別分層進行多因素線性回歸分析，同時在調整了年齡、血壓、吸煙、糖尿病、葉酸和維生素B12水平時發(fā)現(xiàn)，只在男性人群中發(fā)現(xiàn)Hcy與CRAE有相關性，是其危險因素；但是同樣的結果在CRVE中卻未發(fā)現(xiàn)，這與我們的結果有相似之處，但是性別因素在Hcy和眼底血管直徑中的關系中所起的影響還需要進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了我國北方人群中視網膜小動脈和小靜脈的狹窄均與血漿中Hcy水平的升高有關聯(lián)，而這種關聯(lián)似乎只存在于男性人群中，需要進一步進行前瞻性研究來驗證性別差異，并確認Hcy與視網膜小血管直徑之間實時的關系。本發(fā)現(xiàn)為Hcy可能會影響全身微循環(huán)提供了更進一步的證據，同時眼底血管直徑的變化可以和Hcy一起作為心腦血管事件的監(jiān)控和預測因子。