劉建曉 殷慧文 陳偉 徐寧 楊明 王曉莉 趙巖松

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)常見于青光眼、視網(wǎng)膜血管閉塞和糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼部疾病[1]，是目前造成視力障礙和失明的主要原因。因此，尋找RIRI行之有效的治療方案成為眼科研究的焦點。N-乙酰-5-羥色胺(N-acetylserotonin，NAS)是褪黑素的前體物質(zhì)[2-3]，具有抗氧化、抗凋亡等生物學(xué)功能。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NAS可減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，但不同劑量的NAS治療對RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的影響尚未見報道，選擇適宜劑量的NAS對于治療RIRI具有重要意義。本研究采用HE染色、免疫組織化學(xué)和TUNEL法來觀察腹腔注射不同劑量的NAS對RIRI大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)、活性Caspase-3蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響，以期為NAS較優(yōu)劑量的選擇及其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組健康成年雄性SD大鼠42只，體質(zhì)量220～250 g(濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司)。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(6只)、RIRI 組(18只)和NAS組(18只)；NAS組按照給藥劑量的不同分為NAS低劑量組(5 mg·kg-1)、NAS中劑量組(10 mg·kg-1)和NAS高劑量組(20 mg·kg-1)。NAS組于造模前后 30 min腹腔給藥，RIRI 組腹腔注射相應(yīng)等體積的生理鹽水。

1.1.2 主要試劑與儀器NAS(美國，Sigma公司)；兔抗活性 Caspase-3(美國，Cell Signaling Technology公司)；兔抗二步法試劑盒(PV-9001)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(ZLI-9018)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；HE 染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；TUNEL試劑盒(德國，Roche公司)。石蠟切片機(Shandon Finesse325，美國Thermo公司)、研究級正置光學(xué)顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)，電子分析天平(AL-204，美國Mettler Toledo公司)。

1.2 方法

1.2.1 RIRI動物模型制作采用前房高眼壓法建立大鼠RIRI模型[6]。100 g·L-1水合氯醛(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，5.5號針頭自大鼠右眼顳側(cè)角膜緣刺入前房(確保角膜內(nèi)皮、虹膜和晶狀體無損傷)，升高鹽水瓶，使眼壓增加至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，可見眼底蒼白，角膜霧濁，前房變深。直接檢眼鏡觀察發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜血流中斷，RIRI造模成功。持續(xù) 60 min，拔出針頭，視網(wǎng)膜血供恢復(fù)，可樂必妥眼液滴眼預(yù)防感染。

1.2.2 標(biāo)本采集及石蠟切片的制作各組大鼠于RIRI后24 h，取右側(cè)眼球用40 g·L-1多聚甲醛固定，去除晶狀體后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后行石蠟包埋，平行于眼球矢狀位行非連續(xù)切片，每4～5張切片取1張，厚度為4 μm。

1.2.3 HE染色石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染液染核，雙蒸水終止染色，分化液分化，脫洗，伊紅染色30 s，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇脫色，體積分?jǐn)?shù)100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，應(yīng)用Cellsens1.6圖像分析軟件測量視盤外200～300 μm距離內(nèi)任意四點的內(nèi)界膜至外叢狀層內(nèi)緣的距離，取平均值，并計數(shù)該100 μm長度內(nèi)單位面積視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)數(shù)量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測活性Caspase-3蛋白表達(dá)石蠟切片脫蠟至水，98 ℃水浴抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2去離子水去除內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清消除背景非特異著色，加入兔抗活性Caspase-3(1100)，4 ℃冰箱過夜；37 ℃恒溫箱復(fù)溫后用0.01 mol·L-1PBS沖洗，滴加抗兔二抗試劑盒試劑，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木素染核，體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察，計數(shù)RGC層和內(nèi)核層活性Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 TUNEL染色法檢測視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K工作液37 ℃孵育30 min，加TUNEL反應(yīng)混合液暗盒中37 ℃孵育60 min，轉(zhuǎn)化型-POD 信號轉(zhuǎn)化30 min，DAB顯色劑與底物反應(yīng)顯色，蘇木素染核，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下計數(shù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層凋亡細(xì)胞數(shù)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)規(guī)整，細(xì)胞排列整齊，RGC形態(tài)規(guī)則，分布均勻(圖1A)。RIRI組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度[(60.54±2.52)μm]和NAS低、中、高劑量組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度[(56.78±1.78)μm、(53.24±1.68) μm、(52.71±1.52) μm]均較正常對照組[(49.82±1.50)μm]增厚(F=126.992、84.001、22.755、18.293，均為P<0.01)。RIRI組RGC數(shù)[(719.89±83.67)個·mm-2]和NAS低、中、高劑量組[(882.09±55.62)個·mm-2、(1113.65±74.40)個·mm-2、(1132.20±96.15)個·mm-2]均較正常對照組[(1489.17±113.50)個·mm-2]明顯減少(F=277.143、190.464、70.870、50.140，均為P<0.01)。NAS各劑量組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞較RIRI 組排列整齊，內(nèi)層水腫減輕，厚度變薄(F=12.315、52.407、63.694，均為P<0.01)，RGC數(shù)增加(F=21.521、111.310、89.496，均為P<0.01)。NAS中、高劑量組較NAS低劑量組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度變薄(F=17.825、25.808，均為P<0.01)，RGC數(shù)顯著增多(F=51.660、40.584，均為P<0.01)；而NAS中劑量組和NAS高劑量組比較，內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度和RGC數(shù)變化不大(F=0.482、0.202，均為P>0.05)。見圖1。

2.2 各組視網(wǎng)膜中活性Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)比較正常對照組可見極少量的活性Caspase-3陽性細(xì)胞，為(95.37±10.93)個·mm-2；RIRI組為(246.08±19.23)個·mm-2，NAS中劑量組[(142.77±18.25)個·mm-2]和NAS高劑量組[(133.10±15.19)個·mm-2]較低劑量組[(196.95±19.83)個·mm-2]活性Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均有減少(F=70.154、93.722，均為P<0.01)；NAS中劑量組與NAS高劑量組比較，活性Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.644，P>0.05)。RIRI組和NAS各劑量組活性Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均多于正常對照組(F=400.048、178.283、46.592、37.777，均為P<0.01)。NAS各劑量組活性Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均顯著少于RIRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.016、119.816、280.008，均為P<0.01)。見圖2。

圖1 各組大鼠造模后視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400)。A：正常對照組，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞排列緊密；B：RIRI組，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)稀疏，內(nèi)層水腫明顯，細(xì)胞排列紊亂；C：NAS低劑量組，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)較整齊；D、E：NAS中、高劑量組，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)整齊，內(nèi)層明顯變薄，細(xì)胞排列緊密

圖2 各組視網(wǎng)膜中活性Caspase-3陽性細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (×400)。A：正常對照組，視網(wǎng)膜僅見少量活性Caspase-3陽性細(xì)胞；B：RIRI組，視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量活性Caspase-3陽性細(xì)胞，提示大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡嚴(yán)重；C：NAS低劑量組，視網(wǎng)膜可見較多活性Caspase-3陽性細(xì)胞；D、E：分別為NAS中、高劑量組，可見較少活性Caspase-3陽性細(xì)胞。箭頭示活性Caspase-3陽性細(xì)胞

2.3 各組視網(wǎng)膜中凋亡細(xì)胞數(shù)的比較正常對照組視網(wǎng)膜偶見少量凋亡細(xì)胞，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)為(81.98±11.29)個·mm-2；NAS低劑量組[(175.06±17.69)個·mm-2]、中劑量組[(108.85±13.41)個·mm-2]和高劑量組[(100.37±13.53)個·mm-2]TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均較RIRI組[(225.45±18.93)個·mm-2]減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.148、274.132、250.125，均為P<0.01)。NAS中、高劑量組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均較NAS低劑量組減少明顯(F=115.660、113.680，均為P<0.01)；NAS中、高劑量組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.112，P>0.05)。RIRI組和NAS各劑量組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均多于較正常對照組(F=454.790、241.139、29.109、11.525，均為P<0.01)。見圖3。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜石蠟切片TUNEL染色結(jié)果 (×400)。A：正常對照組，凋亡細(xì)胞極少；B：RIRI組，大鼠RGC層和內(nèi)核層出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞；C：NAS低劑量組，視網(wǎng)膜內(nèi)層凋亡細(xì)胞較多；D、E：分別為NAS中、高劑量組，內(nèi)核層凋亡細(xì)胞較少。箭頭示凋亡細(xì)胞

3 討論

RIRI常見于眼科多種疾病，早期由于活性氧的大量產(chǎn)生可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)以及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。RIRI早期，RGC層、內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層明顯水腫、增厚，RGC數(shù)減少。本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后24 h，RIRI組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度較正常對照組明顯增加，且RGC數(shù)較正常對照組減少，這均與文獻(xiàn)報道一致[7]，同時，也證明本研究中RIRI模型造模成功。鑒于NAS具有抗凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用[8-9]，本研究探討不同劑量NAS對RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷的影響，對其臨床應(yīng)用也具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI大鼠給予NAS治療后，NAS各劑量組大鼠視網(wǎng)膜厚度均較 RIRI 組變薄，RGC數(shù)均較RIRI組增加，推測NAS治療可減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫并保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞，從而減輕大鼠RIRI。RIRI后24 h，NAS中、高劑量組療效均優(yōu)于NAS低劑量組，且NAS中、高劑量組之間視網(wǎng)膜厚度及RGC數(shù)變化不明顯，提示中劑量NAS治療是較優(yōu)方案。不同劑量NAS治療對RIRI大鼠遠(yuǎn)期視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)及RGC數(shù)的影響及其相關(guān)機制有待進(jìn)一步研究。

RIRI可導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)活化介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡經(jīng)典途徑，其中活性Caspase-3作為Caspases 的主要效應(yīng)物，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白[10-11]。RIRI后，視網(wǎng)膜細(xì)胞在凋亡信號級聯(lián)反應(yīng)的作用下，Asp175 殘基上的非活性Caspase-3發(fā)生裂解，產(chǎn)生有活性的Caspase-3蛋白。原位末端標(biāo)記檢測(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)是檢測細(xì)胞凋亡常用的方法，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中凋亡細(xì)胞的檢測[12]。Champlin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后6 h，RGC層及內(nèi)核層凋亡細(xì)胞數(shù)較正常對照組顯著升高，24 h達(dá)到較高水平，之后凋亡細(xì)胞數(shù)下降。本研究采用免疫組織化學(xué)法和TUNEL法觀察不同劑量NAS治療對RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討NAS治療大鼠RIRI優(yōu)選的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIRI后24 h，RIRI 組大鼠視網(wǎng)膜RGC層及內(nèi)核層出現(xiàn)大量的活性Caspase-3陽性和TUNEL陽性細(xì)胞，且顯著多于正常對照組，進(jìn)一步證明RIRI大鼠模型制作成功；NAS各劑量組視網(wǎng)膜活性 Caspase-3陽性、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均顯著少于RIRI組，提示NAS可減輕細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。NAS不同劑量組間比較，發(fā)現(xiàn)NAS低劑量組活性Caspase-3陽性細(xì)胞、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均多于NAS中、高劑量組，而NAS中劑量組和NAS高劑量組之間活性Caspase-3陽性細(xì)胞、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差別變化不顯著，提示中、高劑量NAS治療方案抗凋亡療效佳，中劑量NAS治療達(dá)到較好的療效，是RIRI大鼠治療的優(yōu)選。

綜上所述，不同劑量NAS治療均可抑制RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中活性Caspase-3蛋白的表達(dá)及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，中劑量NAS治療方案較優(yōu)，抑制細(xì)胞凋亡效果較佳，可減輕RIRI，具有神經(jīng)保護(hù)作用，為NAS臨床治療RIRI提供了一定的理論依據(jù)。