訾迎新 鄧宇 冀美琦 秦亞麗 金明

形覺(jué)剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)學(xué)說(shuō)創(chuàng)立于1977年，美國(guó)Wiesel教授等[1]縫合新生恒河猴的眼瞼后，縫合眼產(chǎn)生明顯的軸性近視。根據(jù)研究需要，有學(xué)者相繼在樹(shù)齁[2-3]、雛雞[4]、小鼠[5]、大鼠[6]、豚鼠[7]等動(dòng)物眼上開(kāi)展近視的研究。研究證實(shí)對(duì)幼年動(dòng)物施行形覺(jué)剝奪，被剝奪眼眼軸異常生長(zhǎng)，形成明顯近視[8-9]。近視的發(fā)生受遺傳易感性與環(huán)境暴露等復(fù)雜因素的影響[10]，高度近視可因嚴(yán)重的并發(fā)癥導(dǎo)致患者視力永久性損害，甚至失明，已經(jīng)成為重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、公共衛(wèi)生問(wèn)題[11]。高度近視形成機(jī)制也非常復(fù)雜，Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)鞏膜缺氧是近視的觸發(fā)因素，鞏膜由成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，細(xì)胞外基質(zhì)重塑是玻璃體腔加深、眼軸變長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究擬建立豚鼠FDM模型模擬高度近視狀態(tài)，觀察鞏膜形態(tài)改變，測(cè)定鞏膜中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)相對(duì)表達(dá)量、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力，探討氧自由基與形覺(jué)剝奪性高度近視(form deprivation high myopia，F(xiàn)DHM)形成的關(guān)系，為進(jìn)一步研究近視尤其是高度近視提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取2周齡普通級(jí)三色健康豚鼠50只，體質(zhì)量100～140 g，雌雄不限，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心[許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0002]；本研究動(dòng)物使用經(jīng)倫理委員會(huì)同意(倫審號(hào)：180103)，且遵循ARVO關(guān)于眼科和視覺(jué)研究中對(duì)動(dòng)物的處理原則。將豚鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0013]。飼養(yǎng)條件：室溫25 ℃，空氣相對(duì)濕度45%～50%，予以12 h光照(500 lux)，黑暗循環(huán)，實(shí)驗(yàn)期間所有豚鼠自由攝食、進(jìn)水，并給予富含維生素的飼料及新鮮蔬菜等以補(bǔ)充維生素C。實(shí)驗(yàn)前檢查所有豚鼠雙眼前節(jié)和眼底，排除眼部疾病者。

1.1.2 主要儀器及試劑帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)，鏡片箱(丹陽(yáng)醫(yī)療器械廠)，A型眼科超聲測(cè)量?jī)x(ODM-1000，天津邁達(dá)醫(yī)學(xué)科技有限公司)，抗鼠HIF-1α抗體(11000)(GB11031，Servicebio)，抗鼠ACTIN抗體(13000)(GB12001，Servicebio)，SOD檢測(cè)試劑盒(KGT001100)、MDA檢測(cè)試劑盒(KGT004)(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 FDHM模型的建立和分組將豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(25只)和模型組(25只)。模型組豚鼠術(shù)前3 d雙眼予5 g·L-1左氧氟沙星滴眼液滴眼預(yù)防感染，以4 mL·kg-1體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射100 g·L-1戊巴比妥鈉，待麻醉滿(mǎn)意后將豚鼠側(cè)臥位置于操作臺(tái)上，左眼予3.00 g·L-1卡波姆滴眼液滴眼防止角膜干燥，右眼予0.25 g·L-1慶大霉素生理鹽水混合液沖洗結(jié)膜囊，左手持鑷子輕輕提起上瞼，右手持眼科剪從內(nèi)眥部距瞼緣2～3 mm處剪向外眥部，下瞼操作同上，操作完成后，用5-0的絲線縫合豚鼠上、下眼瞼，術(shù)后予4 g·L-1妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天檢查眼瞼縫線，一旦發(fā)現(xiàn)脫落，立即重新縫合。所有模型組豚鼠均選擇右眼作為FDHM組，對(duì)側(cè)眼為自身對(duì)照組。空白對(duì)照組豚鼠不做任何處理。

1.2.2 各組豚鼠屈光度及眼軸長(zhǎng)度檢測(cè)所有豚鼠在形覺(jué)剝奪前、形覺(jué)剝奪8周后進(jìn)行散瞳驗(yàn)光。驗(yàn)光前以5 g·L-1復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散大瞳孔，麻痹睫狀肌，采用帶狀光檢影鏡暗室下進(jìn)行檢影驗(yàn)光，每只眼重復(fù)測(cè)量3次取平均值，散光度以半數(shù)計(jì)入球鏡度。以4 g·L-1鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉，A超測(cè)量眼軸各組成部分長(zhǎng)度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置超聲在眼內(nèi)不同介質(zhì)的傳播速度：前房和玻璃體為1537 m·s-1，晶狀體為1532 m·s-1。測(cè)量時(shí)探頭垂直角膜平面，且盡可能對(duì)準(zhǔn)瞳孔中心，不壓迫角膜，取圖形較穩(wěn)定、清晰且晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線為確定圖像，每眼重復(fù)測(cè)量8次，取平均值。記錄數(shù)據(jù)包括眼軸長(zhǎng)度、前房深度(包括角膜厚度和前房深度)、玻璃體腔深度、晶狀體厚度(眼軸長(zhǎng)度減去前房深度和玻璃體腔深度)。

1.2.3 各組豚鼠眼鞏膜的組織病理學(xué)觀察形覺(jué)剝奪8周后以8 mL·kg-1體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射100 g·L-1戊巴比妥鈉，過(guò)量麻醉處死空白對(duì)照組及模型組各10只豚鼠，摘取雙側(cè)眼球置于冰塊上，沿角膜緣環(huán)形剪開(kāi)眼球，去除眼前節(jié)及玻璃體。每組各取5只后段鞏膜組織固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液內(nèi)，脫水，石蠟包埋，切片厚5 μm，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察鞏膜組織著色情況；每組各取5只后段鞏膜組織制作1 mm×1 mm眼球壁組織塊，戊二醛溶液4 ℃冰箱固定24 h后，鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片(厚約500 μm)，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察拍片。

1.2.4 Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量形覺(jué)剝奪8周后取每組各5只豚鼠，麻醉處死方法同上，剝離鞏膜固定在液氮中，提取蛋白質(zhì)，以BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各樣本蛋白濃度，沸水浴變性15 min，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，選擇100 g·L-1不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用50 g·L-1的脫脂牛奶，封閉1 h。加入11000的抗鼠HIF-1α抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光、顯影。以Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，以抗鼠Actin抗體(13000)作內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量(目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/Actin條帶灰度值)。

1.2.5 比色法檢測(cè)SOD的活力及MDA的含量形覺(jué)剝奪8周后，麻醉處死每組各10只豚鼠，用顯微鑷剝離鞏膜，以精密分析天平稱(chēng)鞏膜濕重，加雙蒸水，以1 mL預(yù)冷的試劑勻漿成100 g·L-1的勻漿液。3000 r·min-1離心勻漿液5 min，取上清液待檢測(cè)。參照SOD活力檢測(cè)試劑盒要求，使用96孔板設(shè)置樣品孔和空白對(duì)照孔，依次加入待測(cè)樣品和其他各種溶液，加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻，37 ℃孵育30 min，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度，參考說(shuō)明書(shū)上的公式計(jì)算SOD活力；參考MDA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)管吸光度，取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度為0.103～0.112，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)上的公式計(jì)算MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，本研究中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。FDHM組與空白對(duì)照組間比較采用兩因素方差分析，F(xiàn)DHM組與自身對(duì)照組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。FDHM組豚鼠鞏膜組織中SOD活力、MDA含量的關(guān)系采用Pearson線性相關(guān)分析，并對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠眼球屈光狀態(tài)的變化豚鼠出生時(shí)均為遠(yuǎn)視眼，3 周齡豚鼠的眼球屈光度約為+3.50 D，形覺(jué)剝奪前各組間屈光度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。形覺(jué)剝奪8周后，F(xiàn)DHM組屈光度高于空白對(duì)照組和自身對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；三組遠(yuǎn)視屈光度均降低，向近視發(fā)展，屈光度高于形覺(jué)剝奪前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組豚鼠形覺(jué)剝奪前后屈光度的變化

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與自身對(duì)照組比較，#P<0.01；與形覺(jué)剝奪前比較，△P<0.05

2.2 豚鼠眼球A超檢測(cè)結(jié)果形覺(jué)剝奪8周后，F(xiàn)DHM組玻璃體腔深度、眼軸長(zhǎng)度均高于空白對(duì)照組和自身對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；三組豚鼠玻璃體加深、眼軸增長(zhǎng)，均高于形覺(jué)剝奪前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。各組間的前房深度、晶狀體厚度在形覺(jué)剝奪前后比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組在形覺(jué)剝奪前后A超測(cè)量參數(shù)的變化

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與自身對(duì)照組比較，#P<0.05；與形覺(jué)剝奪前比較，△P<0.05

2.3 光鏡觀察結(jié)果空白對(duì)照組豚鼠眼鞏膜厚度正常，成纖維細(xì)胞核染呈藍(lán)紫色，梭形或長(zhǎng)圓形，細(xì)胞外基質(zhì)呈粉紅色，膠原纖維排列整齊，走行正常，直徑均勻；FDHM組豚鼠鞏膜明顯變薄，成纖維細(xì)胞核扭曲變形，膠原纖維分布稀疏，直徑明顯減小，排列紊亂、扭曲，有斷裂、分離現(xiàn)象，纖維間空隙增大，細(xì)胞外基質(zhì)增多。自身對(duì)照組鞏膜厚度稍變薄，但形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)圖1。

2.4 電鏡觀察結(jié)果鞏膜組織由纖維母細(xì)胞和與眼球壁平行的膠原束堆積而成，其中膠原纖維構(gòu)成鞏膜組織的框架。觀察膠原纖維橫斷面直徑，空白對(duì)照組和自身對(duì)照組鞏膜無(wú)明顯差別；而FDHM組膠原纖維直徑顯著減小，密度降低。見(jiàn)圖2。

2.5 各組豚鼠鞏膜HIF-1α的表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組、自身對(duì)照組相比，F(xiàn)DHM組鞏膜HIF-1α蛋白表達(dá)升高。FDHM組鞏膜HIF-1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.70±0.15，空白對(duì)照組和自身對(duì)照組分別為0.10±0.06、0.36±0.08，F(xiàn)DHM組與空白對(duì)照組和自身對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.6 各組豚鼠鞏膜中SOD活力和MDA含量SOD活力與脂質(zhì)過(guò)氧化物的主要產(chǎn)物MDA的含量呈相反的變化趨勢(shì)。正常情況下，即空白對(duì)照組中鞏膜的SOD保持高活力，而MDA處于低水平。形覺(jué)剝奪8周后，F(xiàn)DHM組鞏膜SOD活力低于空白對(duì)照組和自身對(duì)照組，MDA含量高于空白對(duì)照組和自身對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組豚鼠鞏膜形態(tài)HE染色 (×400)

圖2 電鏡下各組豚鼠鞏膜超微結(jié)構(gòu)變化 (×5000)

表3 各組豚鼠鞏膜SOD活力和MDA含量

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與自身對(duì)照組比較，#P<0.05

3 討論

由于豚鼠的屈光狀態(tài)、正視化機(jī)制與人類(lèi)相似，豚鼠出生時(shí)為遠(yuǎn)視眼，3周內(nèi)眼軸迅速增長(zhǎng)，11周時(shí)屈光狀態(tài)穩(wěn)定在輕度遠(yuǎn)視眼，完成正視化過(guò)程，豚鼠FDM模型已廣泛應(yīng)用于近視的實(shí)驗(yàn)研究[13-14]。研究顯示：形覺(jué)剝奪以后，角膜變平，前房加深，晶狀體增厚，眼軸增長(zhǎng)，遠(yuǎn)視屈光度下降[15]。本研究采用3周齡的豚鼠進(jìn)行造模，此時(shí)豚鼠處于視覺(jué)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)造模比較敏感，通過(guò)延長(zhǎng)形覺(jué)剝奪時(shí)間，旨在造成高度近視狀態(tài)[16]。生理?xiàng)l件下，鞏膜組織不斷接受外來(lái)光線刺激而發(fā)生光氧化作用，促進(jìn)氧自由基形成，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在有效的抗氧化物質(zhì)如SOD等可及時(shí)清除氧自由基，使氧自由基的生成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡，HIF-1α作為維持氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，為鞏膜等組織提供了保護(hù)作用。病理情況下，氧自由基生成過(guò)多或機(jī)體抗氧化能力不足，可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，其主要代謝物MDA能引起細(xì)胞和組織的損傷。MDA的含量反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基攻擊的程度；SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，其活力反映機(jī)體清除氧自由基的能力[17-18]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)DHM眼鞏膜中HIF-1α、MDA含量升高，SOD活力降低。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)豚鼠眼瞼縫合進(jìn)行形覺(jué)剝奪8周后，近視屈光度加深，最高可造成-8.00 D屈光狀態(tài)；A超進(jìn)行生物測(cè)量顯示形覺(jué)剝奪8周后豚鼠玻璃體腔延長(zhǎng)、眼軸變長(zhǎng)，表明高度近視造模成功；自身對(duì)照眼與空白對(duì)照眼相比，所有參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明形覺(jué)剝奪眼不會(huì)干擾對(duì)側(cè)眼的自然發(fā)育，與Zhao等[19]研究結(jié)果一致。FDHM眼鞏膜形態(tài)發(fā)生病理性改變，鞏膜變薄、膠原纖維直徑變小，與對(duì)照組鞏膜比較，粗纖維缺乏，纖維間區(qū)域增大，膠原纖維分布排列缺乏梯度變化，推測(cè)可能與近視鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成速率低于膠原纖維的形成有關(guān)。