李蓉 姚楊 杜軍輝 姚國敏 王小娣 張進(jìn)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，也是全球工作人群致盲的首位眼病[1-2]。DR發(fā)生的病理機(jī)制十分復(fù)雜，普遍認(rèn)為，高血糖是導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管慢性損傷的主要因素，最終促使病理性視網(wǎng)膜新生血管形成，即疾病晚期進(jìn)入增生型DR(proliferative DR，PDR)期，從而嚴(yán)重威脅患者視力[3]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)可分泌多種細(xì)胞因子，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)新生血管形成的關(guān)鍵因子[4-6]。有研究證實，VEGF與眼內(nèi)新生血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，VEGF的增加可顯著促進(jìn)PDR患者視網(wǎng)膜新生血管的形成[7]。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制，通過溶酶體降解自身細(xì)胞質(zhì)成分來滿足細(xì)胞自身的代謝需要及細(xì)胞器的更新，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，缺氧或高糖條件下的自噬激活能夠顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A的遷移和管腔樣結(jié)構(gòu)的形成[9-10]。RPE在生理狀態(tài)下保持著基本的自噬水平，且隨著年齡增長和疾病發(fā)生而改變[11]?；诖?，本研究觀察高糖條件下人RPE細(xì)胞自噬水平的變化對其VEGF蛋白表達(dá)、RF/6A細(xì)胞遷移和管腔樣結(jié)構(gòu)形成的影響，為進(jìn)一步研究自噬在DR中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人RPE細(xì)胞株(ARPE-19，取5～10代細(xì)胞用于實驗)、RF/6A細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、2.5 g·L-1胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(美國Hyclong公司)；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；3-MA(美國Selleck公司)；兔多抗自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈 3(microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3)B(#2775)，兔多抗Beclin-1(#3738)(美國Cell signaling公司)，兔抗人自噬相關(guān)的特異性基因3(autophagy-related gene 3，Atg3；11262-2-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；兔多抗GAPDH(AB-P-R 001，杭州賢至生物有限公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1054，武漢博士德生物工程有限公司)；人VEGF ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，型號IX51)；微型高速離心機(jī)(美國Labnet公司，型號C2500-R-230V)；全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific公司，型號Multiskan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理2.5 g·L-1胰蛋白酶消化ARPE-19及RF/6A細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)終止消化，收集細(xì)胞PBS清洗后，吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，傳代至培養(yǎng)皿中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞按每孔500×103個接種于6孔板中，貼壁后將細(xì)胞分為對照組、高糖組、3-MA+高糖組，其中對照組在無糖DMEM中培養(yǎng)24 h；高糖組在DMEM培養(yǎng)基中加入30 mmol·L-1葡萄糖溶液處理24 h；3-MA+高糖組細(xì)胞先用10 mmol·L-13-MA處理24 h，然后處理方法同高糖組。此后，在RF/6A細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入以上三組ARPE-19細(xì)胞上清液，將RF/6A細(xì)胞也分為對照組、高糖組和3-MA+高糖組。

1.2.2 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞中LC3、Beclin-1和Atg3蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，PBS洗3次，每次1 min，加入400 μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h。滴加相應(yīng)一抗，LC3、Beclin-1、Atg3及GADPH稀釋比例均為11 000，4 ℃搖床孵育過夜。TBST充分洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(150 000)，室溫下?lián)u床孵育2 h，洗膜后ECL顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1和Atg3蛋白相對表達(dá)量，每組重復(fù)測量3次，取其平均值。

1.2.3 ELISA法檢測ARPE-19細(xì)胞外VEGF蛋白表達(dá)將處理好的細(xì)胞加入ELISA試劑盒的96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，加上覆膜，36 ℃反應(yīng) 90 min；棄去板內(nèi)液體，甩干后每孔加100 μL稀釋后的生物素標(biāo)記人VEGF抗體，加上覆膜，36 ℃溫育 1 h；棄去液體，每孔加入350 μL的洗脫液洗3次，每次浸泡30 s；吸干液體，每孔加100 μL稀釋后的酶結(jié)合稀釋液或工作液，加上覆膜，36 ℃溫育30 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干后洗板5次，每孔加入100 μL顯色劑，酶標(biāo)板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。結(jié)束后每孔加入100 μL終止液，立即用酶標(biāo)儀在 450 nm 測定各孔吸光度(A)值。以VEGF標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，A值為橫坐標(biāo)，做直線相關(guān)回歸分析，根據(jù)待測樣本的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其VEGF濃度。

1.2.4 Transwell小室法檢測RF/6A細(xì)胞的遷移能力取處于對數(shù)生長期的RF/6A細(xì)胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔500×103個細(xì)胞均勻接種到6孔板中，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件過夜。按1.2.1分組處理細(xì)胞，胰蛋白酶消化收集，離心、去上清，PBS洗2次去掉殘余血清，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至200×103mL-1。在24孔板中加入800 μL DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，并放入Transwell小室，在上室分別接入200 μL各組細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS清洗一次，每次1 min，體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h，5 g·L-1結(jié)晶紫染液染色20 min，PBS清洗3次，每次1 min，干凈棉球擦拭上室一側(cè)未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照、計數(shù)。

1.2.5 Matrigel膠法檢測RF/6A細(xì)胞的管腔形成能力4 ℃過夜融化Matrigel膠，將每孔200 μL Matrigel膠加至24孔板，37 ℃孵育40 min。取按1.2.1方法處理過的細(xì)胞，按每孔200×103個接種于鋪好膠的24孔板內(nèi)，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜。隨機(jī)選取3個放大100倍的視野拍照，采用 Image J軟件計算管腔數(shù)(每3個分叉處為1個血管腔)，計算平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組ARPE-19細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相對表達(dá)量比較Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、高糖組和3-MA+高糖組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比值分別為0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048，Beclin-1蛋白相對表達(dá)量分別為0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082，Atg3蛋白相對表達(dá)量分別為0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019，各組整體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(LC3-II/LC3-I：F=52.92；Beclin-1：F=15.00；Atg3：F=23.38；均為P<0.01)。其中高糖組和3-MA+高糖組細(xì)胞中各指標(biāo)均明顯高于對照組，3-MA+高糖組細(xì)胞中各指標(biāo)均明顯低于高糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1以及Atg3蛋白表達(dá)變化。A：LC3-II/LC3-I、Beclin-1和Atg3蛋白Western blot電泳圖。B、C、D：各組細(xì)胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1和Atg3蛋白相對表達(dá)量比較；與對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.01(LSD-t檢驗，n=3)；MA：甲基腺嘌呤

2.2 各組ARPE-19細(xì)胞外VEGF蛋白表達(dá)量比較ELISA檢測結(jié)果顯示，對照組、高糖組和3-MA+高糖組細(xì)胞上清液中VEGF蛋白表達(dá)量分別為(44.03±9.08)ng·L-1、(205.70±17.90)ng·L-1和(112.52±21.06)ng·L-1，各組整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=70.03，P<0.01)。其中高糖組和3-MA+高糖組細(xì)胞外VEGF蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組，3-MA+高糖組細(xì)胞外VEGF蛋白表達(dá)量明顯低于高糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.3 各組RF/6A細(xì)胞遷移數(shù)比較Matrigel膠法檢測結(jié)果顯示(圖2)，對照組、高糖組和3-MA+高糖組細(xì)胞遷移數(shù)分別為(125.60±6.35)個、(153.60±19.20)個和(67.40±7.95)個，各組整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=153.95，P<0.01)。其中高糖組細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于對照組，3-MA+高糖組細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于高糖組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.4 各組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)比較細(xì)胞培養(yǎng)后24 h，各組細(xì)胞均有明顯的管腔樣結(jié)構(gòu)形成，其中高糖組管腔形成較多，對照組和3-MA+高糖組管腔形成較少(圖3)。對照組、高糖組和3-MA+高糖組細(xì)胞管腔形成數(shù)分別為(12.22±0.84)個、(18.44±1.68)個和(5.44±0.51)個；各組細(xì)胞管腔形成數(shù)整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=100.82，P<0.01)。其中高糖組細(xì)胞管腔形成數(shù)明顯高于對照組，3-MA+高糖組細(xì)胞管腔形成數(shù)明顯低于高糖組和對照組(均為P<0.01)。

圖2 倒置顯微鏡下各組RF/6A細(xì)胞遷移情況(標(biāo)尺=100 μm)。 A：對照組可見較多細(xì)胞遷移；B：高糖組遷移細(xì)胞明顯多于對照組；C：3-MA+高糖組細(xì)胞遷移數(shù)明顯少于高糖組和對照組；MA：甲基腺嘌呤。圖3 倒置顯微鏡下各組RF/6A細(xì)胞管腔形成情況(標(biāo)尺=100 μm)。A：對照組細(xì)胞管腔結(jié)構(gòu)清晰可見；B：高糖組形成的管腔數(shù)明顯多于對照組；C：3-MA+高糖組細(xì)胞形成的管腔數(shù)明顯少于高糖組和對照組；MA：甲基腺嘌呤

3 討論

本研究表明，高糖條件明顯誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的自噬激活，并促進(jìn)RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白以及RF/6A細(xì)胞的遷移和管腔形成過程；而抑制RPE細(xì)胞自噬能夠降低其VEGF的表達(dá)水平和RF/6A細(xì)胞的血管形成。以上結(jié)果說明，自噬能夠調(diào)控RPE細(xì)胞的VEGF表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)高糖條件下視網(wǎng)膜血管生成。據(jù)此，調(diào)控RPE細(xì)胞表達(dá)關(guān)鍵細(xì)胞因子VEGF可能是自噬參與調(diào)控DR視網(wǎng)膜新生血管形成的重要途徑。結(jié)合以往研究結(jié)果[9-10]，我們認(rèn)為自噬的激活可以一方面直接促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成，另一方面上調(diào)RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF，間接促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成，抑制自噬有望通過多種途徑成為抑制視網(wǎng)膜病理性新生血管形成的新靶點。

RPE細(xì)胞具有多種復(fù)雜的生理生化功能，如屏障功能、吞噬功能、參與視循環(huán)代謝、抗氧化功能，其中分泌生長因子，如VEGF等參與自身的功能調(diào)節(jié)或多種眼部疾病的發(fā)生是RPE的重要功能之一[12]。研究證實，VEGF一方面能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增殖，增加血管通透性，誘導(dǎo)血管生成[4]；另一方面還能上調(diào)血漿纖溶酶原激活物表達(dá)，引起血漿蛋白外滲，激活多元醇代謝途徑，增加內(nèi)皮細(xì)胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，誘發(fā)甘油二酯和蛋白激酶C機(jī)制，促進(jìn)血管生長[5-6]。在DR的發(fā)生發(fā)展過程中，血-視網(wǎng)膜屏障破壞致使某些細(xì)胞因子滲入眼內(nèi)，刺激視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)，眼內(nèi)液中VEGF的含量也同時增高[13]；另外內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF受體數(shù)目增多、親和力增強，VEGF與受體結(jié)合后促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，最終共同導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成[14]。正常情況下，內(nèi)源性血管抑制因子的影響占優(yōu)勢，故無病理性血管形成。在病理狀態(tài)下，會導(dǎo)致血管生成因子表達(dá)的增多和(或)血管抑制因子降低，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生。在PDR患者眼內(nèi)，VEGF表達(dá)升高而血管抑制因子表達(dá)降低可能是新生血管形成的主要原因[15]。本研究以ARPE-19細(xì)胞為觀察對象，發(fā)現(xiàn)在高糖條件下，RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF明顯增加，進(jìn)而促進(jìn)RF/6A細(xì)胞的遷移和管腔形成，與既往研究結(jié)果相符。

一般情況下，處于正常范圍內(nèi)的自噬對細(xì)胞能夠起到一定的保護(hù)與修復(fù)作用，以利于細(xì)胞應(yīng)對各種應(yīng)激[16]。LC3、Beclin-1、Atg3等被廣泛用作自噬標(biāo)記蛋白。在自噬體的形成過程中，ATG12-ATG5系統(tǒng)和 LC3(ATG8)兩個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)負(fù)責(zé)自噬體膜的延伸，Atg3和ATG5是ATG12-ATG5泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)的重要組成分子[17]。LC3以 LC3-I(胞漿型)和 LC3-II(膜型) 兩種形式存在，當(dāng)自噬形成時，LC3-I酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II[18]。Beclin-1是酵母ATG6的同源基因，是其他自噬蛋白基因參與自噬形成過程的關(guān)鍵成分[19]。LC-II/LC-I常與Beclin-1、Atg3等蛋白水平相結(jié)合以評價細(xì)胞自噬水平的高低。3-MA是廣泛用于自噬研究的Class III PI3K抑制劑，作用于早期自噬誘導(dǎo)階段，特異性阻斷自噬體的形成，使LC3-II/LC3-I下降，并抑制Beclin-1、Atg3的表達(dá)[20]。本研究結(jié)果表明，在高糖環(huán)境下，RPE細(xì)胞的自噬被激活，LC3-II/I、Beclin-1及Atg3蛋白表達(dá)增加；3-MA作用抑制自噬體的形成，導(dǎo)致以上蛋白表達(dá)下降。此外，10 mmol·L-1是用3-MA作用于ARPE-19 細(xì)胞的常用濃度[21]，故本研究也同樣采用此濃度用于實驗。

總之，本研究結(jié)果初步提示除直接影響血管生成過程外，調(diào)控RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF可能是自噬促進(jìn)DR視網(wǎng)膜新生血管形成的另一重要途徑。不過，自噬對RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，本研究將ARPE-19細(xì)胞上清液加入RF/6A細(xì)胞培養(yǎng)基中，只檢測了上清液中的VEGF蛋白含量，故不能排除RPE細(xì)胞表達(dá)的其他生長因子對RF/6A細(xì)胞的影響，在后續(xù)研究中應(yīng)利用VEGF特異性抑制劑等方法進(jìn)行觀察。