楊 雪 李云亮 王禹程 黃姍芬 陸 峰 馬海樂*

（1 承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學院 河北承德067000 2 江蘇大學食品與生物工程學院 江蘇鎮(zhèn)江212013）

酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質成分，分子質量在20～25 ku 之間，約占牛乳總蛋白質的80%以上[1]，但是由于酪蛋白的蛋白單體通過α-螺旋、β-折疊和β-轉角等蛋白質二級結構形成緊密的酪蛋白空間結構，所以在人體內難以消化，并存在易過敏的缺陷，這些因素限制了酪蛋白在食品領域中的應用[2]。近年來在酪蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)很多具有重要生理功能的多肽[3-4]。用酪蛋白制備多肽，不僅能防止酪蛋白產(chǎn)生的過敏反應，同時還可為機體提供大量具有生物學功能的多肽。制備多肽還是提高酪蛋白利用率的有效方法。

多肽因具有多種生物學活性，無毒副作用而廣泛應用于保健食品的開發(fā)。酶解法是制備多肽常用的方法之一[5-6]，然而傳統(tǒng)的酶解方法存在許多缺點，例如酶解時間長，酶利用率低及底物轉化率低等。這主要是由于在酶解過程中的不均勻攪拌，引起底物與酶的低接觸頻率，酶活降低以及蛋白質的聚集和沉積[7]。因此，研究人員一直在研究不同的加工方法，以提高酶的利用率、底物的轉化率，縮短酶解時間。

近年來，超聲波技術迅速發(fā)展，被廣泛應用于輔助制備多肽的工藝中。有研究表明，超聲波可以顯著提高酶解產(chǎn)物的生物學活性[8-9]。酪蛋白呈酸性，在堿性條件下緩慢溶解。采用經(jīng)可溶化預處理的酪蛋白為底物，酶解制備ACE 抑制肽鮮有報道。因此，本文采用酪蛋白為原料，研究可溶化、超聲以及可溶化結合超聲預處理對酪蛋白酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響，以期為蛋白預處理工藝研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

酪蛋白，美國Sigma-Aldrich 公司；堿性蛋白酶（酶活257 364.5 U/mL），諾維信有限公司；血管緊張素轉化酶（Angiotensin I-converting enzyme，ACE），根據(jù)Maruyama 等[10]方法制備；N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3 -（2 -furylacryloyl）]-L -phenyalanyl -glycyl -glycine，F(xiàn)APGG），美國Sigma-Aldrich 公司；試驗中使用的其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器及設備

超聲波細胞粉碎機，無錫市上佳生物科技有限公司；Tecan Infinite PRO TWIN 200 多功能酶標儀，瑞士帝肯（TECAN）集團公司；上海雷磁ZD-2 型自動電位滴定儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；HH-501 超級恒溫水浴鍋，金壇市白塔新寶儀器廠；DL-5 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；S-433D 氨基酸分析儀，賽卡姆（北京）科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酪蛋白酶解 稱取20 g 酪蛋白，加入400 mL 蒸餾水，于50 ℃水浴預熱10 min，混勻的同時用1 mol/L NaOH 調節(jié)pH 值至8.0，然后開始酶解，具體步驟：加入0.5 mL 堿性蛋白酶開始酶解，酶解過程中不斷滴加1 mol/L NaOH，保持pH 值恒定，并記錄NaOH 用量，以預先設定的水解度為終點，記錄不同水解度條件下消耗的時間，酶解結束后于沸水浴條件下滅酶10 min，冷卻至室溫，調節(jié)pH 值至7.0 后，于10 000 r/min 離心10 min，取上清液待測。

1.3.2 可溶化對酪蛋白酶解效果的影響 稱取20 g 酪蛋白，加入400 mL 蒸餾水，放于50 ℃水浴中，調節(jié)pH 值至8.0 后，保溫至酪蛋白全部溶解后開始酶解，操作步驟同1.3.1 節(jié)。

1.3.3 超聲預處理對酪蛋白酶解效果的影響 稱取20 g 酪蛋白，加入50 ℃預熱的蒸餾水400 mL，超聲10 min 后，放入50 ℃水浴預熱10 min，混勻的同時用1 mol/L NaOH 調節(jié)pH 值至8.0，然后開始酶解，操作步驟同1.3.1 節(jié)。

1.3.4 可溶化結合超聲對酪蛋白酶解效果的影響稱取20 g 酪蛋白，加入400 mL 蒸餾水，放于50℃水浴中，調節(jié)pH 值至8.0 后，保溫至酪蛋白全部溶解，然后超聲10 min，超聲結束后將燒杯取出放入50 ℃水浴預熱10 min，混勻的同時用1 mol/L NaOH 調節(jié)pH 值至8.0，然后開始酶解，操作步驟同1.3.1 節(jié)。

1.3.5 水解度（DH）的計算 蛋白酶解過程中水解度的計算方法采用pH-stat 方法[11]，其計算公式如下：

式中，h——被裂解的肽鍵數(shù)；htot——為常數(shù)，即每個底物中蛋白中含有的肽鍵總數(shù)，酪蛋白為8.2 mmol/g[4]；B——消耗的堿液體積，mL；N——堿液濃度，mol/L；α——酪蛋白的平均解離度；m——底物中蛋白質總質量，g。

1.3.6 酪蛋白酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的測定ACE 抑制活性的測定方法參照丁青芝[12]的方法稍有修改[13]。（1）緩沖液的配制：稱取HEPES 1.910 g 和NaCl 1.755 g，加適量的蒸餾水，攪拌至將其完全溶解后，調節(jié)溶液pH 值至8.3，定容至100 mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩＃?）FAPGG 的配制：稱取19.97 mg FAPGG，加緩沖溶液溶解并定容至50 mL，于4 ℃避光保存?zhèn)溆?。?）樣品的配制：酶解液樣品用緩沖液稀釋150 倍，ACE 用緩沖液稀釋80 倍。ACE 抑制率的測定方法及加樣順序見表1。

表1 ACE 抑制活性的測定方法Table 1 Determination method of ACE inhibitory activity

在340 nm 波長下，分別測定對照孔和樣品孔的初始吸光度（a1和b1），酶標板于37 ℃條件下保溫30 min 后再測定其吸光度（a2和b2），每個樣品測定3 次重復。對照孔的吸光度減少值A=a1-a2，樣品孔的吸光度減少值B=b1-b2。酶解液樣品ACE抑制率的計算公式如下：

1.3.7 多肽含量測定 取1.25 mL 樣品溶液，加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，混勻后靜置30 min，然后10 000 r/min 離心10 min，將上清液全部轉移到50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。多肽含量采用福林酚法測定，具體試驗步驟參照Ledoux 和Lamy[14]的試驗方法，樣品于680 nm波長下測定其吸光值。

1.3.8 酶解液的氨基酸組成分析 酶解液氨基酸含量測定方法參照Li 等[15]。不同預處理后的蛋白酶解液樣品放在密封管中，在110 ℃條件下用6 mol/L HCl 水解24 h。水解后用濾紙過濾樣品，并定容至50 mL。取出1 mL 稀釋樣品，通過0.22 μm膜過濾后，使用氨基酸分析儀進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結果采用SPSS 21.0 軟件單因素方差分析 （IBM 公司，NY，USA）P<0.05 的顯著性水平下進行分析。圖表采用OriginPro8（OriginLab 公司，MA，USA）繪制。

2 結果與分析

2.1 不同預處理方式對酪蛋白不同水解度酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率的影響

不同預處理方式對酪蛋白不同水解度酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率的影響見圖1，不同方式預處理酪蛋白，其酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性均呈相同趨勢，即隨著水解度的不斷升高，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性呈先升高后趨于平緩。由圖1a 可知，酪蛋白直接進行酶解，其酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性在水解度為15%時達到最大值，隨后保持平穩(wěn)，在水解度為21.3%時達到酶解終點。由圖1b 可知，酪蛋白經(jīng)過可溶化處理之后，其酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性在水解度為17%時達到最大值，隨后保持平穩(wěn)，在水解度為24.58%時達到酶解終點。由圖1c 可知，酪蛋白經(jīng)過超聲預處理，其酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性不斷增加（P<0.05），在水解度為19%時達到最大值，隨后保持平穩(wěn)，在水解度為25.95%時達到酶解終點。由圖1d 可知，酪蛋白經(jīng)過可溶化結合超聲預處理后，其酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性在水解度為19%時達到最大值，隨后保持平穩(wěn)，在水解度為31.08%時達到酶解終點。

圖1 不同預處理方式對酪蛋白不同水解度酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率的影響Fig.1 Effect of different pretreatments on ACE inhibitory rate of hydrolysate with different DH of casein

在酪蛋白相同水解度條件下比較可知，不同的預處理方式其酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性由高到低排序依次為：可溶化結合超聲、超聲、可溶化、對照。例如，在水解度為19%時，與對照組相比，可溶化、超聲和可溶化結合超聲預處理酪蛋白，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性分別提高了17.96%，25.32%和34.33%。且不同預處理方式，酪蛋白最終水解度不同，也就是說，不同的預處理方式均改變酪蛋白的酶解終點。原因可能是：（1）在酶解過程中，可溶化或超聲均可促進蛋白溶解，增加了酶與底物之間的接觸頻率，提高了酶解效率；（2）堿性蛋白酶在酶解的過程中會隨酶解時間的延長，酶活逐漸喪失，超聲作用可在一定程度上提高堿性蛋白酶的酶活[16]，延長蛋白酶滅活時間。可溶化與超聲預處理均能提高酪蛋白酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性，可溶化提高酶與底物的接觸頻率，超聲使酪蛋白改性為更易酶解的結構，因此可溶化結合超聲預處理方式綜合了兩者的優(yōu)勢，不僅在蛋白構象上更加適宜蛋白酶酶解，并且在酶與底物的接觸頻率方面也顯著提高，從而提高了酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性。

2.2 不同預處理方式對相同水解度條件下酪蛋白酶解時間的影響

不同預處理方式對相同水解度條件下酪蛋白酶解時間的影響見圖2，由圖2可知，在酶解前期，不同處理對酪蛋白酶解時間的變化不明顯，隨著酶解過程的進行，在相同水解度條件下，可溶化、超聲及可溶化結合超聲3 種預處理方式均能縮短酶解時間，這與Madadlou 等[17]的研究結果一致，其研究結果表明，超聲可大幅度縮短（6 倍）酪蛋白制備ACE 抑制肽的時間。結合2.1 節(jié)的試驗結果得出，不同的預處理均可縮短酶解時間，并提高酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性，其中可溶化結合超聲預處理的效果最佳。

2.3 不同預處理方式對酶解終點多肽含量的影響

不同預處理方式對酶解終點多肽含量的影響見圖3，由圖3可知，與對照組相比，不同預處理方式均可顯著提高酶解終點的多肽含量（P<0.05），其中可溶化與超聲處理無顯著差異（P>0.05），3 種預處理方式分別提高了17.54%，20.89%和32.09%。此結果與ACE 抑制活性的結果一致。由此可知，3種預處理方式均能通過提高酶解液中多肽的含量來提高酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性。Zou 等[18]的研究結果也表明，超聲能夠顯著提高酶解產(chǎn)物中多肽的含量和活性。且可溶化結合超聲預處理方式提高酶解液中多肽含量的幅度最大，這說明此種處理方式對于制備ACE 抑制肽來說是相對更有效的預處理方法。

圖2 不同預處理方式對酪蛋白相同水解度條件下酶解時間的影響Fig.2 Effect of different pretreatments on enzymatic time of different DH of casein

圖3 不同預處理方式對酶解終點多肽含量的影響Fig.3 Effect of different pretreatments on peptide content of enzymatic terminal point

2.4 不同預處理方式對酶解產(chǎn)物氨基酸組成的影響

不同預處理方式對酶解產(chǎn)物氨基酸組成的影響見表2，由表2可知，不同預處理方式均能顯著提高酶解產(chǎn)物中總氨基酸含量和疏水性氨基酸含量，其中，可溶化結合超聲預處理方式增加疏水性氨基酸及總氨基酸的含量幅度最大。有研究表明，疏水性氨基酸與酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性有關[19-20]。因此可以得出，不同預處理方式可通過改變酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量而提高其活性。疏水性氨基酸含量的增加表明不同的預處理方式均能使堿性蛋白酶更容易攻擊疏水基團，生成短鏈的具有ACE 抑制活性的多肽，從而提高酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性。

表2 預處理方式對酶解產(chǎn)物氨基酸組成的影響 （μg/mL）Table 2 Effect of pretreatments on amino acid composition of hydrolysate （μg/mL）

3 結論

本文研究了可溶化、超聲及可溶化結合超聲預處理對酪蛋白堿性蛋白酶及產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響，以及不同預處理方式對酪蛋白酶解終點多肽含量及氨基酸組成的影響。得出以下4 個結論：

（1）可溶化、超聲及可溶化結合超聲預處理均能提高相同水解度條件下酪蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性；

（2）可溶化、超聲及可溶化結合超聲預處理可改變酪蛋白的酶解終點；

（3）可溶化、超聲及可溶化結合超聲預處理可通過提高酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸的含量來提高酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性；

（4）可溶化結合超聲是相對更有效的預處理酪蛋白制備ACE 抑制肽的方式。