曹 宇，張喬曄，花 蕊，馬曉玲，汪 旭，3，倪 娟 ，3，*

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650500；2.上海三譽(yù)華夏基因科技有限公司，上海 201101；3.云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

基因組不穩(wěn)定性(genomicinstability，GIN)是眾多人類遺傳-環(huán)境疾病的基礎(chǔ)誘因，其與出生缺陷、免疫缺陷和退行性疾病(如老年性癡呆、心血管疾病、腫瘤等)危險(xiǎn)度增加高度相關(guān)[1-3]。GIN少量增加可以誘發(fā)細(xì)胞周期停滯，使細(xì)胞對(duì)受損基因組進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重且不可逆的GIN時(shí)，細(xì)胞便會(huì)出現(xiàn)生存劣勢(shì)，最終走向死亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚和老鸛草素等多酚類物質(zhì)均可通過(guò)誘發(fā)高水平的GIN使癌細(xì)胞走向凋亡，這可能是其抗癌活性的機(jī)制之一[4-5]。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)屬于多酚化合物，存在于幾種天然植物性食品中，包括葡萄、桑葚和花生等。此外，白藜蘆醇的最豐富來(lái)源之一是虎杖(Polygonumcuspidatum)，一種在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中起重要作用的草藥。RSV實(shí)質(zhì)為一種植物抗毒素，由70多種植物產(chǎn)生，以應(yīng)對(duì)壓力等情況感染[6]。Jang等人的一項(xiàng)開創(chuàng)性研究發(fā)現(xiàn)RSV具有抗癌特性[7]，此后大量的體外和體內(nèi)研究表明，RSV可作為癌癥化學(xué)預(yù)防劑，并有助于預(yù)防與年齡相關(guān)的疾病，如心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默病和糖尿病等[8]。

單個(gè)分子如何在多種疾病中發(fā)揮有益效應(yīng)，其是否通過(guò)影響不同類型細(xì)胞的GIN進(jìn)而改變細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，成為本研究的主要關(guān)注點(diǎn)。因此，本研究選用人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460及結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620作為研究對(duì)象，探究RSV對(duì)兩株細(xì)胞GIN及細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

正常人結(jié)直腸上皮細(xì)胞株NCM460和人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620，均為貼壁上皮細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。配制培養(yǎng)基[44.5mLRPMI-1640培養(yǎng)基，5mL新生牛血清，500μLL-谷氨酰胺(l-glutamine，L-Glu)，50μL青霉素/鏈霉素溶液]。用培養(yǎng)基培養(yǎng)NCM460和SW620細(xì)胞株，每2～3d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿75%～90%瓶底面積時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并傳代。

1.2 主要化學(xué)試劑

L-Glu、0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)、新生牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素溶液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購(gòu)自Gibco公司；二甲基亞砜購(gòu)自Biosharp公司；RSV粉末購(gòu)自CaymanChemical公司；0.4%臺(tái)盼蘭染液購(gòu)自Solarbio公司；細(xì)胞松弛素B(cytochalasinb，CB)購(gòu)自Sigma公司；吉姆薩粉末購(gòu)自上海三思爾公司。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

1.3.1 RSV儲(chǔ)備液配制 10mg的RSV粉末溶解于1 mLDMSO中，配置成43.8mmol/L的儲(chǔ)備液，-20℃保存。

1.3.2 藥物處理 將SW620細(xì)胞以4×105/mL的濃度接種至細(xì)胞培養(yǎng)24孔板中，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入預(yù)設(shè)濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的 RSV處理24h。

1.3.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) 藥物處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，50μL胰蛋白酶溶液消化后加450μL培養(yǎng)基吹打細(xì)胞并混勻，取5μL細(xì)胞懸液與5μL0.4%臺(tái)盼蘭染液充分混勻，染色2min，取10μL染好的細(xì)胞懸液置于血球板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量；

1.3.4 計(jì)算細(xì)胞懸液濃度，繪制生長(zhǎng)曲線 計(jì)算公式如下：

1.4 胞質(zhì)阻斷分裂微核分析細(xì)胞組實(shí)驗(yàn)

1.4.1 藥物處理 將NCM460和SW620細(xì)胞分別以3×105個(gè)/mL濃度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板中，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入RSV(0，25和100 μmol/L)處理24h。

1.4.2 CB處理 藥物處理結(jié)束后，用含有CB的培養(yǎng)基更換掉孔中原有的培養(yǎng)基，培養(yǎng)孔中CB的終濃度為4.5μg/mL，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24～28h；

1.4.3 涂片 CB處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，50μL胰蛋白酶消化后加200μL培養(yǎng)基吹打細(xì)胞并混勻；根據(jù)各孔細(xì)胞數(shù)量，取40～100μL的細(xì)胞懸液，用涂片離心機(jī)制片，800r/min、5min，自然風(fēng)干后，將片子放入冰甲醇中，固定15min，取出自然風(fēng)干；將固定好的片子放入吉姆薩工作液中避光染色15～30min，用自來(lái)水洗去浮色，自然風(fēng)干；在涂有細(xì)胞的位置滴加中性樹脂，加蓋玻片封片，自然風(fēng)干。

1.4.4 計(jì)數(shù) 在X1000光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中單核、雙核、三核及三核以上的細(xì)胞(評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為視野內(nèi)，由一個(gè)完整的細(xì)胞膜包被的等大的界限清晰的著色程度相同的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核)，及凋亡細(xì)胞(評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞偽足收縮，體積減小，膜出泡，核高度皺縮，有凋亡小體出現(xiàn)，較正常細(xì)胞核著色更深)；1000個(gè)含有微核(micronucleus，MN，滿足雙核細(xì)胞的條件下，在胞膜范圍內(nèi)，有獨(dú)立于雙核之外且與細(xì)胞核著色相近或較深的不大于細(xì)胞核的1/3的圓形核即為MN)、核質(zhì)橋(nuclearbridge，NPB，滿足雙核細(xì)胞的條件下，在胞膜范圍內(nèi)，有連接于雙核之間且與細(xì)胞核著色相近或較深的不大于細(xì)胞核的1/3的線形物即為NPB)或核芽(nuclearbud，NBud，是MN的前體，滿足MN條件的圓形核經(jīng)由與細(xì)胞核著色相近或較深的較細(xì)的線形物與核相連，即為NBud)的雙核細(xì)胞。以上各指標(biāo)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參見圖1。

圖1 CBMN-Cyt實(shí)驗(yàn)中用于判定NDI、GIN和凋亡的各種指標(biāo)的示意圖

1.4.5 計(jì)算細(xì)胞核分裂指數(shù) 細(xì)胞核分裂指數(shù)(nucleardivisionindex，NDI)的計(jì)算公式如下：

(其中 N、M1、M2、M3、Mn分別代表了細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、雙核細(xì)胞數(shù)、三核細(xì)胞數(shù)及多核細(xì)胞數(shù))

1.4.6 計(jì)算GIN發(fā)生率 含有各指標(biāo)的雙核細(xì)胞數(shù)量分別除以總雙核細(xì)胞數(shù)量可得出細(xì)胞MN、NPB或NBud的發(fā)生頻率，三者的頻率相加即為細(xì)胞GIN發(fā)生率。

1.4.7 計(jì)算細(xì)胞凋亡率 凋亡細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)即為細(xì)胞凋亡率。

1.5 集落形成實(shí)驗(yàn)

RSV(0、25和100μmol/L)處理24h后，消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞，從每個(gè)孔中取出500個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，每孔加入2mL正常培養(yǎng)基，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)9d，每3d更換一次培養(yǎng)基；9d后，棄掉孔中培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次；冰甲醇固定15min；吉姆薩染料染色15～30min，拍照片記錄并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)，使用one-wayANOVA分析白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞集落形成數(shù)的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析，用one-wayANOVA和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析處理藥物對(duì)各GIN及指標(biāo)、細(xì)胞增殖、NDI、凋亡率及克隆形成數(shù)的影響和差異，且當(dāng)P＜0.05時(shí)具有顯著性差異，使用軟件GraphPadPrism 5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 RSV對(duì)SW620細(xì)胞增殖及GIN的影響

圖2 白藜蘆醇對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSV處理SW620細(xì)胞24h后，與0μmol/L對(duì)照組相比，6.25～100 μmol/L 可以顯著抑制細(xì)胞增殖(圖2，P＜0.05)；100μmol/L可以降低NDI(圖3A，P=0.034)，增加細(xì)胞凋亡(圖 3B，P=0.044)和 GIN(圖 3C，P=0.023)，并且MN和NPB的發(fā)生頻率均明顯升高(圖3D，P＜0.05)，提示RSV處理24h可以抑制SW620細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，并誘發(fā)高水平的GIN；洗去RSV繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，100μmol/L可以顯著降低SW620細(xì)胞的集落形成能力(圖4A和B，P=0.000)，顯著增高GIN(圖4C，P＜0.05)，并且MN、NPB和Nbud的發(fā)生頻率均顯著升高(圖4D，P＜0.05)。

圖3 白藜蘆醇作用24h對(duì)SW620細(xì)胞核分裂指數(shù)、凋亡、GIN及各遺傳損傷指標(biāo)的影響

圖4 白藜蘆醇作用24h后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞9d，對(duì)SW620細(xì)胞集落形成能力、GIN及遺傳損傷指標(biāo)的影響

2.2 RSV對(duì)NCM460細(xì)胞GIN和集落形成能力的影響

CBMN-Cyt實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSV處理NCM460細(xì)胞24h后，25和100μmol/L均可以顯著降低細(xì)胞GIN(圖5A，P＜0.05)，增加細(xì)胞NDI(圖5B，P＜0.05)；洗去RSV繼續(xù)培養(yǎng)9d后，25和100μmol/L仍然可以降低細(xì)胞GIN(圖5C，P＜0.01)，而100 μmol/L還可以增加細(xì)胞NDI(圖5D，P=0.034)，并且增強(qiáng)細(xì)胞集落形成能力(圖5E和F，P=0.019)。

圖5 白藜蘆醇對(duì)NCM460細(xì)胞GIN、NDI和集落形成能力的影響

3 討論

高度有序的基因組層級(jí)結(jié)構(gòu)極易被外源性或內(nèi)源性的有害物質(zhì)所破壞，出現(xiàn)DNA重排、基因拷貝數(shù)變異、染色體末端融合以及染色體數(shù)目異常(非整倍體)等GIN現(xiàn)象[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)體基因組穩(wěn)定性會(huì)隨著年齡的增加顯著下降[10]，成為許多年齡相關(guān)疾病，如心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默病和糖尿病等的重要誘因，EGCG、老鸛草素等多酚類化合物具有維護(hù)基因組穩(wěn)定性的效應(yīng)。

RSV作為一種天然植食性多酚，最卓著的特性是具有較強(qiáng)的抗氧化作用。在自身代謝和外源物質(zhì)暴露下，細(xì)胞通常會(huì)聚積大量的以活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)為主的自由基，過(guò)高的ROS會(huì)作為電子供體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子(如DNA)進(jìn)行氧化修飾和抑制蛋白質(zhì)功能，短期內(nèi)可顯著增加雙鏈DNA斷裂、染色體末端融合、染色體易位和重排[11]以及促進(jìn)細(xì)胞死亡[12]，長(zhǎng)期存在則會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生[13]。因此，抑制氧化損傷構(gòu)成對(duì)抗癌癥發(fā)生防御系統(tǒng)的一道防線，其被認(rèn)為是阻止癌癥最有效的方式，大量的細(xì)胞和臨床前期試驗(yàn)表明優(yōu)秀的抗氧化劑可預(yù)防癌癥[14-16]。因此，RSV可能通過(guò)卓越的抗氧化作用保護(hù)維護(hù)正常細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性，本研究發(fā)現(xiàn)，NCM460細(xì)胞中，RSV處理可以顯著降低GIN，并增加細(xì)胞NDI；另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)，RSV能增強(qiáng)癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性[17]。本實(shí)驗(yàn)中，RSV處理SW620細(xì)胞24h可以顯著抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞NDI，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。RSV已被證明能具有調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)sirtuin1(SIRT1)、超氧化物歧化酶(SOD)、核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(NRF2)、一氧化氮合酶(eNOS)等基因的效應(yīng)[18-21]，其可能通過(guò)差異影響抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的影響，在正常和癌細(xì)胞中展現(xiàn)出不同的效應(yīng)，從而維護(hù)正常細(xì)胞基因組穩(wěn)定性，誘發(fā)癌細(xì)胞中基因組不穩(wěn)定性，繼而對(duì)正常和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況也出現(xiàn)差異影響。

表觀遺傳機(jī)制在維護(hù)基因組穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起到重要作用，其異常調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的人類疾病。天然植物化學(xué)物質(zhì)可以通過(guò)影響負(fù)責(zé)染色質(zhì)重塑的機(jī)制和蛋白來(lái)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物表觀基因組。存在于水果、種子和蔬菜植物中的化學(xué)物質(zhì)可作為強(qiáng)效細(xì)胞抗氧化劑和抗癌劑，其中大多均具有表觀調(diào)節(jié)的生物活性[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)RSV具有表觀調(diào)節(jié)活性，在DU145(突變型p53)和LNCaP(野生型p53)前列腺癌細(xì)胞系中，RSV下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MTA1)，導(dǎo)致MTA1/NuRD的穩(wěn)定性降低，從而促進(jìn)p53乙?；罨痆24]。另一項(xiàng)研究顯示RSV可通過(guò)影響乳腺癌全基因組甲基化，繼而調(diào)節(jié)19個(gè)癌基因和8個(gè)抑癌基因的表達(dá)狀態(tài)[25]。大量研究證實(shí)，正常和癌細(xì)胞中常表現(xiàn)不同的表觀調(diào)節(jié)模式，這可能是多酚類物質(zhì)在正常和癌細(xì)胞中出現(xiàn)差異效應(yīng)的另一重要基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，RSV可降低正常細(xì)胞的GIN，同時(shí)誘發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞高水平的GIN，可能是其在多種疾病中表現(xiàn)出有益效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。但本結(jié)果僅限于在體外培養(yǎng)的結(jié)腸細(xì)胞中，在活體中以及其他細(xì)胞類型是否會(huì)得到統(tǒng)一的結(jié)果還有待進(jìn)一步探討。