邢超 高常青 雷苑 孫興懷

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 長(zhǎng)沙 410013)

青光眼是僅次于白內(nèi)障的全球第二大致盲性眼病，衰老是青光眼的“強(qiáng)烈高危誘因” (strong risk factor)[1-2]。隨著全球人口老齡化，預(yù)計(jì)到2020年全球青光眼患者將達(dá)8 000萬(wàn)[3]，其中約有800萬(wàn)的患者將會(huì)失明。我國(guó)50歲以上人群原發(fā)性青光眼患病率為2.1%，致盲率高達(dá)10%。增高的眼壓通過(guò)機(jī)械壓迫和引起視神經(jīng)缺血2種機(jī)制導(dǎo)致視神經(jīng)損害。降眼壓是目前臨床治療青光眼最有效的方法。臨床使用的降眼壓藥物是通過(guò)3種機(jī)制實(shí)現(xiàn)眼壓下降的，包括促進(jìn)經(jīng)典或非經(jīng)典通路房水引流(如毛果蕓香堿、ROCK抑制劑和拉坦前列素等)，減少房水分泌(如β受體阻滯劑等)。目前降眼壓效果最好的前列素衍生物類藥物主要是通過(guò)增加非經(jīng)典通路，即葡萄膜/鞏膜途徑的房水外流來(lái)降眼壓的，但是通過(guò)該通路的房水僅占房水總外流量的4%～17%[4]。 絕大部分(83%～96%[5]) 的房水則是由經(jīng)典房水外流通路 —— 經(jīng)小梁組織和Schlemm管(SC)流出眼球進(jìn)入體循環(huán)。

DBA/2J小鼠作為一種重要的青光眼動(dòng)物模型，用于研究高眼壓相關(guān)的進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglial cell，RGC)減少、視神經(jīng)變性和青光眼視功能障礙[6-8]。虹膜基質(zhì)萎縮是由于酪氨酸相關(guān)蛋白1b突變(Tyrp1b)造成的，虹膜色素分散是由編碼跨膜糖蛋白基因GpnmbR150X的未成熟停止密碼子突變引起的[6,9]。DBA/2J小鼠在3～4月齡時(shí)，會(huì)出現(xiàn)邊緣虹膜缺損，瞳孔邊緣色素分散和虹膜增厚[6]。分散的色素可進(jìn)入前房，并逐漸在小梁網(wǎng)中聚積，從而阻礙了房水的流動(dòng)，導(dǎo)致眼壓升高。在6～9月齡眼壓達(dá)到最高值[6-7]。10～12月齡小鼠出現(xiàn)RGC損失和視覺(jué)功能障礙，最終失明[6]。

然而，作為重要青光眼模型的DBA/2J小鼠，其房水動(dòng)力學(xué)基本參數(shù)尚不明確，常用青光眼藥物對(duì)其降眼壓的效果亦罕見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬測(cè)量DBA/2J小鼠的經(jīng)典通路房水外流系數(shù)，以及選擇常用青光眼藥物拉坦前列素(通過(guò)非經(jīng)典路徑促進(jìn)房水外流)和毛果蕓香堿(通過(guò)經(jīng)典路徑促進(jìn)房水外流)在其不同月齡段的降眼壓效果，來(lái)評(píng)價(jià)不同降眼壓藥物實(shí)驗(yàn)研究的適當(dāng)動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)采用3月齡及10月齡的C57BL/6小鼠和DBA/2J小鼠，分別用0.5%毛果蕓香堿或0.005%拉坦前列素2種藥物滴右眼(干預(yù)眼)，左眼滴磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(對(duì)照眼)，給藥2周。共8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，8只/組，共128眼。C57BL/6小鼠作為本研究的對(duì)照品系，由于其品系穩(wěn)定且易于繁殖，廣泛用于青光眼等疾病模型的建立[10-11]及其藥物機(jī)制[12]的研究。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范都依照ARVO的聲明進(jìn)行。小鼠飼養(yǎng)在白色塑料籠盒里，在12 h/12 h的明暗交替的環(huán)境中使用標(biāo)準(zhǔn)的小鼠糧飼喂。DBA/2J小鼠最初是從杰克遜實(shí)驗(yàn)室購(gòu)得，C57BL/6小鼠從上海南方模式生物研究中心購(gòu)得。

1.2 藥品 本研究使用2種降低眼壓的藥物，分別為毛果蕓香堿 (硝酸毛果蕓香堿滴眼液，5 mL∶25 mg，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司) 和拉坦前列素(拉坦前列素滴眼液, 25 mL∶125 μg，輝瑞制藥，比利時(shí))。毛果蕓香堿每天眼表給藥2次(分別在上午9時(shí)和下午5時(shí))，每次1滴；拉坦前列素每天眼表給藥1次(上午9時(shí))，每次1滴。將藥物滴于右眼共2周；左眼作為自身對(duì)照，給予PBS同樣滴藥。

1.3 眼壓測(cè)量 實(shí)驗(yàn)對(duì)3、10月齡的小鼠雙眼眼壓進(jìn)行測(cè)量。用動(dòng)物專用眼壓計(jì) (Tonolab，Icare)測(cè)量眼壓，每只眼重復(fù)測(cè)量2次，最終眼壓取2次平均值。

1.4 房水動(dòng)力學(xué)測(cè)量 鼠眼按既定的方法灌注[13]。實(shí)驗(yàn)研究小鼠的眼睛在處死后10 min內(nèi)摘除并保存在DMEM培養(yǎng)基中直到灌注。 首先將摘除的眼球固定在支架上，用33 G斜尖納米針套管針安裝在一個(gè)連有玻璃注射器(50 μL, Hamilton, UK)的泵上進(jìn)行小鼠眼前房灌注。運(yùn)用電腦控制注射器泵，將可變流量(Q)輸送到前房，以維持所需的眼壓(壓力傳感器Honey well, model 142PC1G)。在恒定壓力(P)為8、15、22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的條件下，用PBS(Invitrogen, UK)對(duì)眼球進(jìn)行灌注，每個(gè)壓力水平至少灌注20 min。由于是對(duì)摘除的眼球進(jìn)行灌注，為獲得相應(yīng)的體內(nèi)眼壓，需在灌注壓力中加上鞏膜外靜脈壓力，如8 mmHg灌注壓大約相當(dāng)于13～18 mmHg體內(nèi)壓[14-16]。軟件以10 Hz的頻率測(cè)量流量和壓力，每10 s電子記錄1次。房水流暢系數(shù)(C) =流量(Q) /壓力(P)。假設(shè)在平衡狀態(tài)下，總流入量等于總流出量，眼球的鞏膜壓力等于0。通過(guò)對(duì)3種不同壓力 (8、15、22 mmHg)的流量與壓力之間的關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算出經(jīng)典通路房水流暢系數(shù)。

1.5 前房角組織形態(tài) 選擇在恒壓(8 mmHg)時(shí)，注入4%多聚甲醛固定眼球，并保存在4%多聚甲醛中(1～3個(gè)月)，然后處理石蠟嵌入，切片(7 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色。切片用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡觀察 (Leica, 美國(guó))。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Mann-WitneyUtest (SPSS 16, Chicago)分析數(shù)據(jù)。當(dāng)P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 毛果蕓香堿 對(duì)于3月齡小鼠，C57BL/6小鼠使用毛果蕓香堿后眼壓比對(duì)照眼顯著降低了2.0 mmHg(n=8，P<0.05)；而DBA/2J小鼠眼壓降低了2.6 mmHg (n=8，P<0.05，圖1A)。對(duì)于10月齡小鼠，C57BL/6小鼠使用毛果蕓香堿后眼壓顯著下降了3.0 mmHg(n=8，P<0.05)，DBA/2J小鼠眼壓未顯著下降(降幅僅為1.3 mmHg ，n=8，P>0.05，圖1B)。

2.1.2 拉坦前列素 對(duì)于3月齡C57BL/6小鼠，使用拉坦前列素后眼壓顯著下降(n=8，P<0.05，圖1C，圖2)。對(duì)于10月齡小鼠，雖然拉坦前列素仍顯著降低了DBA/2J小鼠的眼壓, 但是眼壓降幅從3月齡時(shí)的29.1%下降到15.6%(n=8，P<0.05，圖1D)。

圖1. 3月齡、10月齡DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠用藥前后眼壓變化

在使用毛果蕓香堿后，3月齡DBA/2J和C57BL/6小鼠眼壓降幅較為相似(分別為13.8%和16.5%)，而10月齡DBA/2J小鼠眼壓下降幅度僅為同月齡C57BL/6小鼠的32%。使用拉坦前列素后，3月齡DBA/2J小鼠眼壓降幅是C57BL/6小鼠的74%，10月齡小鼠其眼壓降幅百分比縮小到68%(圖2)。

藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了2種青光眼藥物(毛果蕓香堿和拉坦前列素)對(duì)3月齡、10月齡的DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠的降眼壓效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)拉坦前列素的降眼壓效果有年齡依賴性。

2.2 基礎(chǔ)房水動(dòng)力學(xué)參數(shù) 10月齡、12月齡的DBA/2J小鼠的眼壓分別為(17.3±2.4)mmHg、(17.7±2.1)mmHg，顯著高于同月齡C57BL/6小鼠的眼壓(11.3±1.1)mmHg和(13.2±1.3)mmHg(圖3A)。本實(shí)驗(yàn)僅選用3月齡和10月齡小鼠進(jìn)行研究。DBA/2J小鼠的房水流出系數(shù)為0.004 1 μL·min-1·mmHg-1，顯著低于正常C57BL/6小鼠的房水流出系數(shù)0.006 8 μL·min-1·mmHg-1(圖3B)。10月齡DBA/2J小鼠與10月齡正常C57BL/6小鼠前房角形態(tài)見(jiàn)圖4。對(duì)比發(fā)現(xiàn)DBA/2J小鼠虹膜分散的色素附著于其小梁網(wǎng)上。

圖2. 對(duì)比3月及10月齡2種小鼠在2種藥物作用下眼壓下降百分比

圖3. 正常DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠眼壓(A)、房水動(dòng)力學(xué)(B)參數(shù)變化

圖4. 10月齡正常C57BL/6(A)小鼠和DBA/2J(B)小鼠前房角形態(tài)。光鏡下前房角組織形態(tài)對(duì)比，HE染色 ×200

3 討論

DBA/2J小鼠攜帶2種自發(fā)的基因突變，可發(fā)展成虹膜基質(zhì)萎縮和虹膜色素分散。其視網(wǎng)膜和視神經(jīng)退化癥狀與人類的慢性青光眼相似[17]。本研究報(bào)道了DBA/2J小鼠作為研究青光眼發(fā)病機(jī)制與治療策略研發(fā)的重要模型，其房水動(dòng)力學(xué)特征及對(duì)2種臨床常用降眼壓藥物(拉坦前列和毛果蕓香堿)的反應(yīng)。

在DBA/2J小鼠上，毛果蕓香堿的降眼壓作用與小鼠年齡高度相關(guān)。對(duì)于3月齡小鼠，毛果蕓香堿能顯著降低DBA/2J 與C57BL/6小鼠的眼壓。而對(duì)于10月齡的DBA/2J小鼠，拉坦前列素仍可以顯著降低其眼壓，但毛果蕓香堿失去了降眼壓作用。

毛果蕓香堿在DBA/2J小鼠上所呈現(xiàn)的年齡相關(guān)性可能與該小鼠的特性及2種藥物的作用機(jī)制有關(guān)。毛果蕓香堿是一種具有直接作用的擬膽堿藥物，可直接刺激位于瞳孔括約肌、睫狀體及分泌腺上的毒蕈堿受體，通過(guò)收縮瞳孔括約肌，使其周邊虹膜離開(kāi)房角前壁，開(kāi)放房角，增加房水排出。同時(shí)還通過(guò)收縮睫狀肌的縱行纖維，增加鞏膜突的張力，使小梁網(wǎng)間隙開(kāi)放，房水引流阻力減小，增加房水排出，從而降低眼壓。3月齡的DBA/2J小鼠，其虹膜彈性較好，紋理清，無(wú)色素脫失、無(wú)萎縮，毛果蕓香堿能夠通過(guò)其作用機(jī)制降低眼壓。而對(duì)于10月齡的DBA/2J小鼠，其虹膜老化，色素分散、脫失，阻塞小梁網(wǎng)。這可能是導(dǎo)致毛果蕓香堿降眼壓作用失效的原因。

拉坦前列素是前列腺素F2α(PGF2α)的類似物,對(duì)前列腺素類受體具有高度選擇性,通過(guò)增加葡萄膜鞏膜的房水外流而降低眼壓。也有文獻(xiàn)[18]報(bào)道拉坦前列素也可通過(guò)經(jīng)典通路降低眼壓，通過(guò)光學(xué)相干層析成像測(cè)量人眼Schlemm管內(nèi)徑，用藥后內(nèi)徑顯著擴(kuò)大。雖然10月齡的小鼠虹膜老化，色素分散，阻塞小梁網(wǎng)，但是拉坦前列素仍能通過(guò)上述途徑降低眼壓。所以，雖然其降眼壓效果較3月齡DBA/2J小鼠有所下降，但仍有顯著降眼壓效果。

有文獻(xiàn)[19]報(bào)道，在單次局部使用拉坦前列素后，眼壓在8～12 h下降到最大，24 h內(nèi)眼壓低于預(yù)處理水平。本研究眼壓的測(cè)量在該藥物的起效時(shí)段內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)延遲效應(yīng)，且該藥物在DBA/2J小鼠上的作用效果與臨床上觀察到的色素性青光眼作用效果一致[20-21]。

綜上所述，DBA/2J小鼠作為青光眼模型，由于其虹膜色素分散、脫離等特點(diǎn)，并非適合所有降眼壓藥物的篩選，特別是通過(guò)經(jīng)典通路降眼壓的藥物。