齊 敏，劉溪林，趙 健，吳 鋒，孫樂(lè)安，鄭蘭榮

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.人體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心；2.研究生學(xué)院；3.人體解剖學(xué)教研室；4.病理解剖學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤在膠質(zhì)瘤(Glioma)中占絕大多數(shù)，具有高侵襲性、高致死率特點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)治療方法(手術(shù)、化療和放療)并沒(méi)有完全解決膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)所致的高復(fù)發(fā)率的難題[2]。越來(lái)越多的研究者從基因水平研究腫瘤侵襲性、血管生成及腫瘤發(fā)生率。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O4(Forkhead boxO4，F(xiàn)OXO4)具有廣泛的生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝、增殖、凋亡和分化[3]。神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)具有神經(jīng)毒性作用[4]。本研究應(yīng)用免疫組化和免疫熒光檢測(cè)FOXO4和nNOS在星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，旨在闡明FOXO4和nNOS在星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 從弋磯山醫(yī)院病理科調(diào)取2013年1月～2018年1月行外科手術(shù)切除的星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本27例，其中男性14例，女性13例；年齡30～75歲。所有星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。術(shù)后病理按WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ級(jí)5例、Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)10例、Ⅳ級(jí)4例。另取材時(shí)采用瘤周組織作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 兔抗FOXO4和nNOS、抗熒光淬滅劑和SABC試劑盒均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。熒光二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，DAPI購(gòu)于南京凱基生物有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè) 取各例星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，片厚5 μm。按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書依次進(jìn)行各步驟，封片，鏡下觀察。高倍鏡下每個(gè)腫瘤切片隨機(jī)選取2個(gè)視野，圖像分析軟件測(cè)量400倍視野下FOXO4與nNOS在不同級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度值(灰度值越大說(shuō)明表達(dá)越弱，反之則越強(qiáng))。對(duì)照組用PBS替代一抗做為陰性對(duì)照。

1.4 免疫熒光檢測(cè) 取各例星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，片厚5 μm。按照免疫熒光的方法依次孵育一抗、熒光二抗、DAPI染核等。最后用抗熒光淬滅劑封片，透明指甲油封邊，在熒光顯微鏡下觀察。高倍鏡下每個(gè)腫瘤切片隨機(jī)選取1個(gè)視野，觀察熒光強(qiáng)弱，比較FOXO4與nNOS在高級(jí)別(Ⅲ、Ⅳ級(jí))與低級(jí)別(Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí))星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況。對(duì)照組用PBS替代一抗做陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 FOXO4的免疫組化和免疫熒光表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，低級(jí)別和高級(jí)別星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤均可見(jiàn)FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞，呈棕黃色或棕褐色，著色主要位于胞核。腫瘤組織FOXO4的陽(yáng)性表達(dá)比瘤周正常腦組織低(圖1)。

結(jié)果顯示，Ⅳ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅱ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值高于Ⅰ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，Ⅳ級(jí)和Ⅲ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值高于Ⅱ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，Ⅳ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值高于Ⅲ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表1。

左上角為瘤周組織，著色較深，右下角為腫瘤組織，著色較淺。黑色箭頭所示為瘤周組織中FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞，紅色箭頭所示為Ⅲ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞。該視野下隨機(jī)選取四個(gè)腫瘤細(xì)胞和四個(gè)瘤周細(xì)胞，測(cè)得灰度值平均值分別為88.72，129.75(SABC法，×200)。

圖1 星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤及瘤周組織中FOXO4表達(dá)

箭頭所示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織中FOXO4 陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺=30 μm(SABC法，×400)。

圖2 各級(jí)別星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織FOXO4的表達(dá)

表1 星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值

組別n灰度值FPⅠ級(jí)565.78±5.25aⅡ級(jí)8105.50±5.61b778.4400.000Ⅲ級(jí)10153.20±1.90cⅣ級(jí)4172.40±1.45d

注：多組間兩兩比較。符號(hào)不同表示P<0.05。

免疫熒光方法檢測(cè)，完成DAPI細(xì)胞核染色(呈藍(lán)色熒光)，F(xiàn)OXO4染色(呈綠色熒光)，兩者疊加(Merge)后可以證實(shí)FOXO4染色基本位于細(xì)胞核。同時(shí)熒光染色條件下，可觀察到低級(jí)別的星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤陽(yáng)性表達(dá)率高于高級(jí)別(圖3)。

2.2 nNOS的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，低級(jí)別和高級(jí)別星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織均可見(jiàn)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞，呈棕黃色或棕褐色，胞質(zhì)和胞膜著色。腫瘤組織FOXO4的陽(yáng)性表達(dá)比瘤周正常腦組織高(圖4)。

圖中用DAPI標(biāo)記的為星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的核定位，可發(fā)現(xiàn)FOXO4的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的增加而降低(免疫熒光，×400)。

圖3 各級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織FOXO4陽(yáng)性表達(dá)

左上角為腫瘤組織，著色較深，右下角為瘤周組織，著色較淺。黑色箭頭所示為瘤周組織中nNOS陽(yáng)性細(xì)胞，紅色箭頭所示為Ⅲ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中nNOS陽(yáng)性細(xì)胞。該視野下隨機(jī)選取四個(gè)腫瘤細(xì)胞和四個(gè)瘤周細(xì)胞，測(cè)得灰度值平均值分別為94.07、158.76(SABC法，×200)。

圖4 星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤及瘤周組織中nNOS表達(dá)

結(jié)果顯示，Ⅳ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅱ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織nNOS陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值低于Ⅰ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織nNOS陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，Ⅳ級(jí)和Ⅲ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織nNOS陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值低于Ⅱ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織nNOS陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，Ⅳ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織nNOS陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值低于Ⅲ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織nNOS陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表2。

免疫熒光結(jié)果顯示，nNOS在高級(jí)別星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)高于低級(jí)別的星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤(圖6)。

表2 星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織FOXO4陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值

組別n灰度值FPⅠ級(jí)5163.30±2.79eⅡ級(jí)8156.10±1.94f464.6890.000Ⅲ級(jí)10114.10±2.45gⅣ級(jí)486.39±8.87h

注：多組間兩兩比較。符號(hào)不同表示P<0.05。

箭頭所示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織中nNOS陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺=30 μm(SABC法，×400)。

圖5 各級(jí)別星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤瘤組織中nNOS的陽(yáng)性表達(dá)

圖中用DAPI標(biāo)記的為星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的核定位，可發(fā)現(xiàn)nNOS的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的增加而增強(qiáng)(免疫熒光，×400)。

圖6 各級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤nNOS陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

人腦星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，與神經(jīng)系統(tǒng)以外的其他腫瘤不同，該腫瘤不發(fā)生轉(zhuǎn)移但具有很強(qiáng)的侵襲性[5]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高度侵襲性和高度血管生成能力是影響預(yù)后的重要原因。FOXO4轉(zhuǎn)錄因子為FOXO家族成員，F(xiàn)OXO家族參與各種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，DNA損傷修復(fù)和分化，并促進(jìn)細(xì)胞死亡[6]。FOXO家族受多種信號(hào)通路調(diào)控，其中最明顯的受PI3K-Akt/PKB介導(dǎo)磷酸化級(jí)聯(lián)通路的負(fù)調(diào)控[7-8]。在鼻咽癌組織中，F(xiàn)OXO4受mir-421的直接靶向作用，引起FOXO4表達(dá)的下調(diào)，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的增殖增強(qiáng)[9]。大量研究顯示，F(xiàn)OXO4在肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等多種人類腫瘤中的表達(dá)都有所下調(diào)或缺失,FOXO4在腫瘤中的表達(dá)較正常組織的表達(dá)減少[6-12]。本研究結(jié)果顯示，隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤級(jí)別的增加，F(xiàn)OXO4的表達(dá)逐漸減少，呈負(fù)相關(guān)，這與FOXO4在其他腫瘤中的表達(dá)基本一致。據(jù)此，結(jié)合既往研究與本研究結(jié)果進(jìn)一步提示，F(xiàn)OXO4可能具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成的作用，其下調(diào)或缺失可致腫瘤的生長(zhǎng)加速。由此可見(jiàn)，F(xiàn)OXO4可能是一個(gè)潛在的非特異性(廣譜)的癌癥治療靶點(diǎn)。

NO是腦組織中重要的信使分子，參與了腫瘤的病理生理過(guò)程[13]。大腦額葉一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)陽(yáng)性神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)其他多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化、增殖、遷移以及大腦血管的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。NOS及其催化L-精氨酸形成的NO，在機(jī)體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)作用,可參與神經(jīng)元發(fā)育、軸突生長(zhǎng)、突觸形成和修復(fù)過(guò)程，在腫瘤形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)NOS及其催化而形成的NO，在口腔鱗癌、胃癌、大腸癌等多種腫瘤中有重要作用[16-18]。NO使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增加，NOS抑制劑可能在神經(jīng)腫瘤學(xué)中有治療作用[18-19]。nNOS為NOS同功酶的三種亞型之一，nNOS被認(rèn)為有神經(jīng)毒性作用[4-5]。正常的腦組織nNOS表達(dá)較少，腦組織的高脂濃度和高能量要求，使其特別容易受到自由基和氧化劑介導(dǎo)的損傷：腦深部神經(jīng)元NADPH-d/nNOS標(biāo)記的神經(jīng)元減少[19]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，nNOS在高級(jí)別(Ⅲ、Ⅳ級(jí))星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)高于低級(jí)別(Ⅰ、Ⅱ級(jí))星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，提示腫瘤相關(guān)因子nNOS的異常高表達(dá)可能與人腦星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性程度以及侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期為治療星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤靶向藥物的研究提供參考資料。

鑒于轉(zhuǎn)錄因子FOXO4和腫瘤相關(guān)因子nNOS參與了腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程[3-4]，本研究結(jié)果表明FOXO4、nNOS的異常表達(dá)可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)有關(guān)，下一步將深入研究驗(yàn)證FOXO4、nNOS與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤病理級(jí)別的關(guān)系，并尋找FOXO4、nNOS兩種因子對(duì)于腫瘤的具體作用機(jī)制和通路，從基因水平進(jìn)一步探討星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。