陳映宇,毛聯(lián)智,劉華緩,孫素霞

陳映宇,毛聯(lián)智,劉華緩,孫素霞,南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系 廣東省 廣州市 510515

核心提要：近年來,有研究發(fā)現(xiàn)腸道產丁酸菌數(shù)量和構成的變化與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的發(fā)生發(fā)展息息相關.除了產生丁酸和丁酸鹽外,部分產丁酸菌還可以通過菌體結構和自身免疫特性發(fā)揮抗IBD作用.本文就腸道產丁酸菌防治IBD的作用機制進行綜述.

0 引言

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性、復發(fā)性胃腸道炎癥,潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)是臨床上定義的IBD的兩種主要類型.IBD臨床癥狀多樣,可波及多個器官系統(tǒng),具有較高的誤診率[1].IBD在西方國家多發(fā),美國有超過100萬居民,歐洲有超過250萬居民患有IBD,而近年來亞洲,南美洲及中東地區(qū)的患病率也在不斷上升,IBD已經演變成了一種全球性疾病[2].我國IBD的發(fā)病率不及西方國家,但呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,是亞洲IBD發(fā)病率最高的國家[3],達到3.14/10萬人,其中UC的發(fā)病率為2.05/10萬人,CD為1.09/10萬人[4].人體是由真核細胞與體內共生的細菌共同組成的“超級生物體”,腸道是細菌定植的主要場所之一[5].腸道菌群的失調與IBD的發(fā)生發(fā)展密切相關,是IBD發(fā)病的基礎[6].腸道菌群對腸上皮細胞的生長與分化、宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫功能的調節(jié)等方面都起到非常重要的作用[7].某些腸道菌群可以在結腸內發(fā)酵未消化的膳食纖維產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA),主要包括乙酸,丙酸和丁酸[8].有研究者在IBD患者和相關動物模型中觀察到一些產丁酸細菌的數(shù)量和多樣性下降,如Faecalibacterium prausnitzii和Roseburia菌屬[9],但產丁酸菌與IBD之間的相互關系尚未清晰.腸道產丁酸菌可以調節(jié)免疫細胞生成的數(shù)量,維護腸上皮細胞屏障功能,以及通過產生的丁酸發(fā)揮抗IBD的作用.本文就腸道產丁酸菌及其在IBD中的作用及其機制進行綜述.

1 腸道產丁酸菌

哺乳動物的腸道中聚集著數(shù)萬億的細菌,可以在人體內介導多種生物化學反應.腸道菌群結構復雜,在結腸中的種類和數(shù)量尤為豐富,有300-400種,數(shù)量可超過1011/g水平[10].腸道菌群可分解并發(fā)酵膳食中的低聚糖等膳食纖維,生成SCFA[11].腸道菌群在維護免疫和代謝穩(wěn)態(tài)以及預防疾病方面發(fā)揮重要作用,其組成的改變與許多炎癥性疾病的發(fā)病機理息息相關[12].近年來,產丁酸菌因其在抗腸道炎癥方面的作用被廣泛認識.產丁酸菌在腸道中產生的丁酸可以為結腸上皮細胞提供能量,提高腸上皮細胞屏障的完整性,調節(jié)腸道菌群的種類和數(shù)量,促進人和動物的腸道健康[13,14].產丁酸菌主要分布在結腸和盲腸中,以厚壁菌門(Firmicutes)為主[15],包括梭桿菌屬(Fusobactierium)、真桿菌屬(Eubacterium)、梭菌屬(Clostridium)、羅氏菌屬(Roseburia)等[16].梭桿菌屬的Faecalibacterium prausnitzii和真桿菌屬的Eubacterium rectale的數(shù)量在人結腸菌群中占比最高[17],將Faecalibacterium prausnitzii和羅氏菌屬的Roseburia intestinalis分離后在M2G培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)發(fā)酵,其產丁酸量高于10 mmol/L,以上三種菌可能是人和動物腸道中的優(yōu)勢產丁酸菌[18,19].梭菌屬的Clostridium butyricum也是人和動物腸道中常見的共生菌,因為其強大的產丁酸能力而命名[20].此外,Eubacterium hallii、Roseburia faecis、Roseburia hominis、Eubacterium ramulus也是腸道產丁酸菌的重要組成類別[15].隨著基因測序等生物技術及色譜、質譜等儀器分析方法的進步和發(fā)展,Mediterraneibacter butyricigenes[21],Clostridium composti[22]等新型產丁酸菌種也被不斷發(fā)現(xiàn)和分離.

2 產丁酸菌在IBD中的變化

過往的研究中人們普遍認為IBD的發(fā)生與腸道菌群的失調及代謝變化密切相關.Takahashi等[23]利用Illumina MiSeq TM Ⅱ系統(tǒng)對10名CD患者和10名健康人的糞便樣本進行16S rRNA測序.結果顯示,與健康人相比,CD病人體內的產丁酸菌種,如Blautia faecis,Roseburia inulinivorans,Ruminococcus torques,Clostridium lavalense,Bacteroides uniformis和Faecalibacterium prausnitzii均顯著減少.Halfvarson等[24]建立了128名IBD患者和9名健康人對照的研究隊列,通過對16s rRNA基因的V4區(qū)域測序,發(fā)現(xiàn)病人體內產丁酸菌Faecalibacterium prauznitzii的豐度與正常個體相比明顯下降.Machiels等[25]采用變性梯度凝膠電泳技術分析了127名UC患者和87名健康人的糞便微生物群,通過實時定量PCR,與對照組相比,UC患者體內兩種產丁酸菌Faecalibacterium prauznitzii和Roseburia hominis的豐度顯著降低.Al-Bayati等[26]調查了40名UC患者和40名正常人結腸腸道菌群的組成,觀察到患者結腸鏡活檢標本中產丁酸菌Faecalibacterium prauznitzii數(shù)量減少.但由于菌群難以在體外培養(yǎng)、菌群在腸黏膜與糞便中分離出的樣本成分存在差異、多數(shù)研究使用的16s核糖體RNA標記測序對菌群分類的精確度不足、研究結果大多基于橫斷面研究等原因,尚不能證明腸道菌群的成分變化與IBD的發(fā)病存在確切的因果關系[27].對于產丁酸菌與IBD的關系,目前大多數(shù)研究僅能闡述發(fā)病過程中產丁酸菌群在腸道中的數(shù)量及成分變化,人們對其內在機制知之甚少.但以上研究結果提示產丁酸菌與IBD之間存在一定的關系,為從產丁酸菌角度防治IBD提供線索.

3 產丁酸菌通過產生丁酸發(fā)揮抗IBD作用

有研究和相關的臨床證據(jù)表明,丁酸及丁酸鹽被認為具有保護腸道黏膜,調節(jié)免疫平衡的作用,是治療IBD的潛在藥物.丁酸鹽可以為腸上皮細胞提供能量,通過促進其增殖分化提高腸黏膜的完整性,阻止致病因子及其他外源性物質入血導致炎癥發(fā)生[28].丁酸鹽還可作為一種組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors,HDACi)參與基因的轉錄調控[29],使DNA與組蛋白八聚體解離,松弛核小體,促進轉錄因子與特異位點結合從而激活轉錄過程.除此之外,丁酸鹽作為HDACi能激活腸上皮細胞的AP-1通路[30],下調炎癥因子的表達水平,并能增加Fas蛋白的表達量誘導T細胞凋亡[31],抑制炎癥的發(fā)生.丁酸鹽也可影響調節(jié)性T細胞(regulatory T,Treg)的增殖分化發(fā)揮抗炎作用.Treg可表達一種對自身免疫和增殖分化有關鍵作用的Foxp3蛋白,丁酸鹽能抑制促炎因子IL-6的表達并通過HDACi作用促使初始T細胞分化為Treg細胞,增加對Foxp3蛋白的表達發(fā)揮抗炎作用[32,33].丁酸鈉還具有激活G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPRs)的作用,特別是GPR43和GPR109a.其作用主要是通過激活GPRs抑制下游MEK-ERK、NF-κB等信號通路,減少促炎因子的分泌,增加抗菌肽LL-37的分泌來抑制炎癥反應[34].此外,丁酸鹽可以抑制JAK2的活性以及γ-干擾素誘導的STAT1蛋白上酪氨酸和絲氨酸的磷酸化,從而抑制 JAKSTAT 通路的活性,使促炎細胞因子和一氧化氮合酶的合成減少[35].綜上所述,產丁酸菌能通過產生丁酸及丁酸鹽提高腸道的免疫屏障作用,促進Treg的增殖分化,激活GPRs,以及抑制炎癥通路如NF-κB、JAK-STAT來控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展,進而發(fā)揮其抗IBD作用.

4 產丁酸菌通過其他途徑發(fā)揮抗IBD作用

除了通過產生丁酸發(fā)揮抗炎作用外,有部分產丁酸菌還可不依賴丁酸及丁酸鹽,而是通過菌體本身的結構和免疫特性發(fā)揮抗炎作用.本文挑選了三種具有這些作用的腸道產丁酸菌,分別為Roseburia intestinalis,Faecalibacterium prausnitzii和Clostridium butyricum,總結近期研究工作者提出或發(fā)現(xiàn)的關于這些菌種在IBD中的作用及其機制.

4.1Roseburia intestinalisRoseburia菌屬由多種革蘭陽性專性厭氧菌構成,有R.intestinalis,R.hominis,R.inulinivorans,R.faecis和R.cecicola五種,屬于Clostridium ClusterXIVa亞群.目前對于Roseburia intestinalis菌種抗IBD的機制有較多新的研究進展.Shen等[36]發(fā)現(xiàn)Roseburia intestinalis可以增加Treg細胞的數(shù)量,提高結腸炎小鼠體內抗炎細胞因子IL-10,TGF-β,TSLP的表達水平,參與由脂多糖誘導的CaCo-2細胞抗炎途徑,發(fā)揮抗炎作用.Quan等[37]通過在小鼠的UC樣品中的微陣列分析和基因測定,發(fā)現(xiàn)Roseburia intestinalis的鞭毛蛋白可能通過增加stat1磷酸化激活H1F1A-AS2啟動子,下調TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-12等炎性細胞因子介導抗炎作用.Zhu等[38]利用三硝基苯磺酸溶液在小鼠體內造IBD模型,通過炎癥發(fā)生前后的病理學評分及炎癥細胞因子的分泌量對比,表明Roseburia intestinalis可以通過NCM460細胞抑制由脂多糖誘導的炎癥細胞因子IL-17分泌,并能增加Treg細胞的數(shù)量對抗IBD.綜上所述,這些新的研究著重闡述了Roseburia intestinalis通過調控Treg等免疫細胞,增加體內抗炎細胞因子的分泌,下調促炎細胞因子的表達水平,以及利用鞭毛蛋白激活啟動子等方面的抗炎機制,為IBD的治療提供了新的思路.

4.2Faecalibacterium prausnitziiFaecalibacterium prausnitzii是人體內含量最豐富的菌種之一,屬于Clostridium Cluster IV亞群,占人體細菌總量的6%-8%[39].Faecalibacterium prausnitzii是腸道中重要的丁酸鹽生產者,除了通過產生丁酸鹽發(fā)揮SCFA的抗炎作用外,其本身也可以通過多條免疫通路來調節(jié)腸道炎癥反應.2008年Sokol等[40]人從人糞中分離了Faecalibacterium prausnitzii的上清液,通過腹腔注射使其進入IBD小鼠體內.結果顯示,用Faecalibacterium prausnitzii處理的兩組IBD小鼠TNF-α,IL-12的分泌水平顯著低于IBD對照組,且用其上清液處理小鼠的結腸可誘導IL-10分泌.Sokol等[40]認為,這種抗炎途徑不是由于丁酸鹽的存在,而是Faecalibacterium prausnitzii獨立的抗炎機制.近期許多由Faecalibacterium prausnitzii介導的新抗炎途徑也被不斷提出和發(fā)現(xiàn).Alameddine等[41]首次提出Faecalibacterium prausnitzii可誘導樹突狀細胞(dendritic cell,DC)表達一系列獨特的Tr1/Treg極化分子,包括IL-27,CD39,IDO-1和PDL-1等抗炎細胞因子,并在TLR4刺激下,抑制炎性細胞因子的分泌,達到抗炎的效果.Sarrabayrouse等[42]則認為腸黏膜CD4CD8ααT淋巴細胞也可以參與表達Foxp3 Treg細胞并分泌IL-10,而CD4CD8ααT淋巴細胞的表達水平與Faecalibacterium prausnitzii的含量存在高度相關性,他們猜測Faecalibacterium prausnitzii參與激活了該免疫通路.Faecalibacterium prausnitzii在IBD中的作用機制是腸道菌群抗炎機制中較為熱門的研究方向,DC和CD4CD8ααT淋巴細胞發(fā)揮的抗炎作用在過往的研究中較少提及,許多學者將通過進一步的臨床試驗和研究證實其作用.

表1 產丁酸菌作用下炎癥性腸病患者或動物體內的細胞因子變化情況

4.3Clostridium butyricumClostridium butyricum是一種嚴格厭氧的革蘭陰性芽孢桿菌,因為其強大的產丁酸能力而命名,是人和動物腸道中常見的共生菌[20].多種動物實驗和臨床實踐中都證實其抗炎作用,現(xiàn)已作為一種商業(yè)化的益生菌菌種[20].Cai等[43]用Clostridium butyricum膠囊治療UC患者,檢測到患者血清中特異性IgE,IL-4和TNF-α的水平下降,提出Clostridium butyricum具有改善UC的作用.Xiao等[44]通過實時PCR及熒光原位雜交技術觀察到Clostridium butyricum在結腸炎模型小鼠體內促進miR-200c的表達,減少促炎細胞因子的產生；還可以增長腸道上皮微絨毛,減少上皮細胞的通透性,抑制炎癥的發(fā)生.Li等[45]認為Clostridium butyricum可以修復腸道緊密連接蛋白,調節(jié)腸道乳酸桿菌等微生物的生長,保護腸上皮細胞的免疫屏障.Kashiwagi等[46]用Clostridium butyricum等梭菌屬混合物定植于結腸炎模型小鼠中,發(fā)現(xiàn)Clostridium butyricum可以依賴Toll樣受體2,激活ERK-AP-1激酶通路,誘導腸壁固有層的樹突細胞中的TGF-β1促進腸道中Treg的形成,調節(jié)腸道的免疫功能.綜上所述,Clostridium butyricum既可通過修復腸道結構提高腸道免疫力,也可通過調節(jié)miR-200c等分子的表達水平或激活相關免疫通路發(fā)揮其抗炎作用(表1).

5 結論

腸道產丁酸菌以Firmicutes為主,包括Fusobactierium、Eubacterium、Clostridium、Roseburia等菌屬.IBD患者和模型動物中的產丁酸菌數(shù)量和多樣性的減少,提示產丁酸菌的變化與IBD的發(fā)病有密切聯(lián)系.多項動物實驗及臨床實踐研究表明產丁酸菌發(fā)揮抗IBD作用,其主要機制可分為以下兩大方面：一是產丁酸菌可通過產生丁酸和丁酸鹽保護腸道黏膜,發(fā)揮HDACi作用,并可調節(jié)Treg細胞的增殖分化,以及激活GPRs,抑制NF-κB、JAK-STAT等信號通路產生抗炎作用.二是產丁酸菌可以通過自身的結構和免疫特性發(fā)揮抗炎作用.除了通過增加Treg細胞數(shù)量,下調炎癥因子表達水平等常見途徑外,有研究者還提出了新的抗炎部位和免疫通路.如Roseburia intestinalis利用鞭毛蛋白通過增加stat1磷酸化激活H1F1A-AS2啟動子等方式保護腸道組織；Faecalibacterium prausnitzii誘導樹突狀細胞,CD4CD8ααT淋巴細胞參與的免疫調節(jié)作用被逐步發(fā)現(xiàn)；Clostridium butyricum能增長腸道微絨毛,增強腸道上皮細胞的屏障作用,防止IBD的發(fā)生和發(fā)展.但由于在目前的研究中,產丁酸菌群難以在體外培養(yǎng),且多數(shù)研究使用的16s核糖體RNA標記測序對菌群分類的精確度不足,菌群在腸黏膜與糞便中分離出的樣本成分存在差異,因此菌群與IBD發(fā)生發(fā)展之間的因果關系尚不十分明確.產丁酸菌抗IBD的作用除了本文所闡述的機制外,在實驗過程中是否存在其他抗炎途徑和干擾因素,目前的研究也沒有準確的定論.因此,有必要進一步了解宿主與細菌相互作用的分子基礎,為今后通過這些機制提高IBD病人體內產丁酸菌的數(shù)量和種類,改善腸道菌群的生態(tài)失調,進而達到改善和治療IBD提供策略.