何怡嵐,張波

何怡嵐,杭州市余杭區(qū)第三人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 浙江省 杭州市 311115

張波,浙江省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科 浙江省 杭州市 310022

核心提要：色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)在胃癌(gastric cancer,GC)細(xì)胞中的表達(dá)量高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)量,GC組織中CBX2 mRNA及蛋白的表達(dá)量高于與其配對(duì)的癌旁組織并且CBX2在GC組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,證明了CBX2蛋白的表達(dá)與GC患者的疾病轉(zhuǎn)歸存在聯(lián)系.

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是世界上第四大常見惡性腫瘤,也是繼肺癌和肝癌后第三大最常見的癌癥死亡原因[1].GC是常見的消化道腫瘤,其發(fā)生呈現(xiàn)早起隱匿性,缺乏敏感有效的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)[2].盡管目前國內(nèi)外在GC的早起檢測(cè),診斷和臨床治療方面取得了一定程度上的突破,但仍舊無法改變GC患者的整體生存預(yù)后情況不容樂觀的事實(shí)[3].各基因通路的相互作用以及原癌基因和抑癌基因功能的失調(diào)等因素與GC的疾病演變關(guān)系密不可分.

色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)是CBX蛋白家族的主要成員,是調(diào)節(jié)染色質(zhì)多梳抑制復(fù)合物(polycomb repressive complex PRC)1復(fù)合物的一個(gè)重要組成部分.CBX2蛋白是參與募集PRC1蛋白至有絲分裂染色體的主要成分[4],而表現(xiàn)出修飾組蛋白并抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的酶活性.研究證明,CBX2在多種癌癥的演變,疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后中起到了至關(guān)重要的作用[5,6].例如,CBX2在乳腺癌中的表達(dá)明顯升高,高表達(dá)的CBX2與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后明顯相關(guān)[7].然而,CBX2影響GC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚,本研究采用Western-blot法、Real-Time熒光定量PCR法和免疫組化法檢測(cè)GC細(xì)胞系及組織中CBX2表達(dá)情況,并分析CBX2的表達(dá)與GC患者的臨床病理資料及生存預(yù)后情況的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2008-05/2012-06浙江省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科收治的66例GC患者的樣本.其中男性46例,女性20例；中位年齡為58.4歲.同時(shí)收集3例GC患者手術(shù)標(biāo)本,保留GC組織和與其配對(duì)的癌旁組織共3對(duì),依次編號(hào)為T1(N1)、T2(N2)、T3(N3).采集的標(biāo)本標(biāo)號(hào)放入EP管后,立刻放入液氮中保存,并封入－80 ℃冰箱保存.患者臨床隨訪資料完備,術(shù)前未經(jīng)化療及放療治療,術(shù)后病理組織經(jīng)本院病理科確診為GC無疑.本研究通過浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn),標(biāo)本的留取及研究均取得患者知情同意.

細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)試劑器材：正常胃黏膜上皮細(xì)胞CES-1及GC細(xì)胞株MGC-80,BGC-823以及MKN-45均購自美國模式菌種保藏中心.Anti-CBX2(ab80044)抗體購自艾博抗(上海),RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司,胎牛血清購自美國Gibco公司；實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電熱恒溫水浴箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；臺(tái)式離心機(jī)購自Thermo公司.微量移液器：型號(hào)10 μL,100 μL和1000 μL購自德國Eppendorf公司.紫外分光光度計(jì)：型號(hào)Nanodrop2000購自Thermo公司；其他：如高壓鍋、冰箱、低溫冰箱、Tip頭、386孔板等均購自上海鼎盛生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：每張組織切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野,平均每個(gè)視野需計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性比例得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果.根據(jù)染色強(qiáng)度分級(jí)為0(無著色),1(淡黃色),2(棕黃色),3(棕褐色).根據(jù)顯色的腫瘤細(xì)胞的百分比,評(píng)分如下：0(＜10%)、1(10%-49%),2(≥50% ).最終的結(jié)果為兩項(xiàng)得分相乘,陽性(≥2分)或陰性(＜2分).

1.2.2 Western blot檢測(cè)：收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞并使用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA法測(cè)定蛋白濃度后置于-80 ℃條件下保存.將樣本蛋白加入上樣緩沖液后,使用98 ℃干浴變性5 min.制備適當(dāng)濃度的濃縮膠及分離膠后,依每孔50 μg定量上樣,使用110V恒壓進(jìn)行電泳,250 mA橫流進(jìn)行濕轉(zhuǎn),將蛋白轉(zhuǎn)至合適大小的PVDF膜中.使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,加入溶有一抗的5%脫脂奶粉液,置于4 ℃搖動(dòng)孵育過夜,一抗稀釋比例為1：1000.在使用TBST溶液清洗PVDF膜后,加入溶有適當(dāng)比例二抗的5%脫脂奶粉液,于室溫下?lián)u動(dòng)孵育1 h.再次使用TBST溶液清洗膜,使用ECL發(fā)光液于暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè).

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：按照說明書使用Trizol提取總RNA,依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng).依據(jù)SYBR Green PCR說明書混合反應(yīng)體系,以GAPDH為參照系進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè).引物經(jīng)由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行合成.通過上述方式進(jìn)行RNA的提取.利用TaqMan?Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0試劑盒對(duì)提取后的樣本進(jìn)行擴(kuò)增.利用7900HT熒光定量PCR系統(tǒng),以CES-1細(xì)胞mRNA表達(dá)量作為內(nèi)參計(jì)算每個(gè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包(IBM公司,美國)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.運(yùn)用χ2檢驗(yàn)來分析CBX2的表達(dá)與臨床病理生理特征的關(guān)系.采用單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算患者的危險(xiǎn)比和95%CI.

2 結(jié)果

2.1 CBX2 mRNA在GC細(xì)胞,GC組織及其配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)情況 采用Real-time熒光定量PCR法檢測(cè)GC細(xì)胞(MGC-80,BGC-823,MKN-45)中CBX2 mRNA的表達(dá)水平與正常胃黏膜上皮細(xì)胞CES-1中的表達(dá)水平相比,結(jié)果顯示(圖1A),三種不同的GC細(xì)胞中CBX2 mRNA的表達(dá)量均高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞CES-1中的表達(dá)量(P＜0.05)；而Western-blot法的檢測(cè)結(jié)果(圖1B)同樣顯示,三種GC細(xì)胞(MGC-80,BGC-823,MKN-45)中CBX2蛋白的表達(dá)量同樣高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞CES-1中的表達(dá)量(P＜0.05).

我們采用上述兩種方法來檢測(cè)3例GC組織和與其配對(duì)的癌旁組織中CBX2的mRNA和蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示(圖1A和B),GC組織中CBX2 mRNA及蛋白的表達(dá)量高于與其配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)量(P＜0.05).

2.2 CBX2蛋白在GC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)66例GC組織及其配對(duì)的癌旁組織中CBX2蛋白的表達(dá)情況,如圖2所示,CBX2在GC組織中的陽性表達(dá)率為40.9%(27/66),在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為12.1%(8/66),CBX2在GC組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).

2.3 GC組織中CBX2表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系根據(jù)66例GC患者中CBX2的表達(dá)情況,分析其與各個(gè)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,結(jié)果如表1所示,CBX2蛋白的表達(dá)與患者的腫瘤轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P＜0.05),與患者的性別,年齡,吸煙史及TNM分期無關(guān)(P＞0.05).

2.4 GC組織中CBX2的表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系 采用Kaplan-Meier法分析66例GC患者的CBX2表達(dá)情況與生存期的關(guān)系,結(jié)果如圖3顯示,CBX2陽性表達(dá)患者的生存率與陰性表達(dá)患者的生存率無顯著差異(P＞0.05).

3 討論

越來越多的證據(jù)表明,包含RNA編輯的表觀遺傳學(xué)改變可能在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用,并可能控制各種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)[8].而癌癥相關(guān)基因的表達(dá)在癌癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后往往起到十分關(guān)鍵的作用[9].PcG蛋白主要形成兩種蛋白質(zhì)復(fù)合物,即PRC2和PRC1.而CBX2蛋白可通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用將PRC1的其他成分募集到染色質(zhì)中[10],其在乳腺癌[7],前列腺癌[11],結(jié)腸癌[12]等多種腫瘤組織中均有表達(dá),參與促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及腫瘤血管的形成.

在本研究中,分別應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法和Realtime熒光定量PCR法檢測(cè)了GC細(xì)胞、正常胃黏膜上皮細(xì)胞、GC組織及其配對(duì)的癌旁正常組織中CBX2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在GC細(xì)胞和GC組織中,CBX2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量均高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞及配對(duì)的癌旁正常組織.本研究同時(shí)探討了CBX2的表達(dá)與GC患者的病理參數(shù)之間的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CBX2蛋白的表達(dá)與患者的腫瘤轉(zhuǎn)移情況有關(guān)；但CBX2陽性表達(dá)患者的生存率與陰性表達(dá)患者的生存率無顯著差異,這可能與本實(shí)驗(yàn)所納入研究的病例數(shù)過少有關(guān).

表1 CBX2的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性

圖1 實(shí)時(shí)定量熒光PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè).A：胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜上皮細(xì)胞中CBX2 mRNA和蛋白的表達(dá)量；B：胃癌組織和與其配對(duì)的癌旁組織中CBX2 mRNA和蛋白的表達(dá)量.

總之,GC細(xì)胞及組織中CBX2呈高表達(dá)狀態(tài),并與結(jié)直腸癌患者的病情預(yù)后及轉(zhuǎn)歸存在一定程度的聯(lián)系,目前國內(nèi)外對(duì)于CBX2與GC的發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系研究尚處于初始階段,本實(shí)驗(yàn)初步探討了CBX2的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制,為今后的基礎(chǔ)及臨床研究提供了一個(gè)可能的研究方向.

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)CBX2蛋白在癌旁正常組織及胃癌組織中的表達(dá)情況.A：正常組織(×400)；B：癌旁組織(×400).

圖3 胃癌患者中CBX2的表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

探究色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)蛋白在胃癌(gastric cancer,GC)患者中的表達(dá)及臨床意義.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

GC的發(fā)病率近年來呈上升趨勢(shì),目前對(duì)于GC的治療前景不容樂觀,尋找新的GC治療靶點(diǎn)刻不容緩.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本文旨在尋找新的GC治療靶點(diǎn),我們發(fā)現(xiàn)CBX2蛋白與GC的發(fā)生發(fā)展具有聯(lián)系.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用了Western-blot、Real-Time熒光定量PCR法、免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行研究,通過對(duì)病例臨床資料的分析,得到研究結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本文證實(shí)了CBX2蛋白在GC細(xì)胞中的表達(dá)量高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)量,GC組織中CBX2 mRNA及蛋白的表達(dá)量高于與其配對(duì)的癌旁組織并且CBX2在GC組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,證明了CBX2蛋白的表達(dá)與GC患者的疾病轉(zhuǎn)歸存在聯(lián)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)CBX2蛋白與GC的發(fā)生發(fā)展存在了一定的聯(lián)系,未來可以進(jìn)行更深入的研究CBX2是否可以作為GC治療的有效靶點(diǎn).

展望前景

下一步我們將尋找CBX2通過何種信號(hào)通路來影響GC的發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r的.