蔡羽恬 郭寧寧 郭遠(yuǎn) 王璐媛 劉莉萍 李遇梅

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，鎮(zhèn)江212001

拉坦前列素（latanoprost）是一種前列腺素F2α（PGF2α）類似物，被用于治療眼內(nèi)壓升高性疾病，包括高眼壓和開角型青光眼[1]。根據(jù)拉坦前列素使虹膜及眼周皮膚色素沉著增加的藥物不良反應(yīng)，其對于白癜風(fēng)等色素脫失性疾病的治療前景得以探討[2]。數(shù)項(xiàng)初步臨床研究發(fā)現(xiàn)，外用拉坦前列素對局限型、穩(wěn)定期白癜風(fēng)皮損效果顯著，且其效能至少與一線用藥（如0.1%他克莫司）相當(dāng)[3-6]。為進(jìn)一步探討拉坦前列素對表皮黑素細(xì)胞的作用，我們將拉坦前列素作用于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞，研究其對黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的作用。

材料與方法

1.細(xì)胞來源：從青少年包皮中分離人表皮黑素細(xì)胞后原代培養(yǎng)、傳代，至第3 ～5代時(shí)使用。本實(shí)驗(yàn)所用包皮全部來源于泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后的遺棄標(biāo)本，供者年齡＜25歲，均無白癜風(fēng)病史或家族史。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號：SWYXLL20170901），取材前均獲得供者知情同意。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑：拉坦前列素粉末（純度99.7%，美國TargetMol 公司），以二甲基亞砜（美國Sigma公司）配制成10-2mol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存，實(shí)驗(yàn)前將其配制成各實(shí)驗(yàn)濃度。分散酶（美國Sigma 公司），254 培養(yǎng)基和人黑素細(xì)胞生長添加物（HMGS）（美國Gibco 公司），CCK8 試劑盒（日本DOJINDO公司），Triton X-100（合肥博美生物科技有限公司），Masson-Fontana 黑素染色液（美國Solarbio公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒（日本Takara 公司），小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國Millipore公司），MITF、TYR、TYRP1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.黑素細(xì)胞原代分離與培養(yǎng)：取包皮環(huán)切術(shù)后組織，用含青鏈霉素雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，剪除皮下及部分真皮組織，剪成5 mm×5 mm大小，置于0.3%分散酶中消化8 ～12 h。取出組織塊，用PBS 沖洗后分離表真皮。將表皮剪碎，加入0.25%胰酶-乙二胺四乙酸，消化10 min，用膠頭滴管輕吹懸液后，4 ℃、1 000 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min，重懸、計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)/ml密度接種于直徑6 cm 培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，待細(xì)胞生長至70%～80%皿底面積時(shí)，加入0.025%胰酶-乙二胺四乙酸消化傳代。選用3 ～5代黑素細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用黑素的嗜銀性，將Masson-Fontana 銀染色后可見褐黑色黑素的細(xì)胞鑒定為黑素細(xì)胞。

4.實(shí)驗(yàn)分組與處理：前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已排除藥物載基對細(xì)胞的影響，并已測拉坦前列素對人表皮黑素細(xì)胞的IC50值為8.8×10-5mol/L，且10-8mol/L及更小濃度的拉坦前列素處理黑素細(xì)胞后，細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成及相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，將拉坦前列素加入254培養(yǎng)基配制成10-5、10-6、10-7mol/L分別處理培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞，對照組僅用不加拉坦前列素的培養(yǎng)基處理。

5.CCK8 法檢測黑素細(xì)胞增殖：將黑素細(xì)胞以1 × 104個(gè)/孔接種 96 孔板，每孔 100 μl。按上述方法分組給藥處理48 h，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl CCK8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度（A值）。細(xì)胞增殖水平以A450表示。

6.多巴比色法檢測酪氨酸酶活性：將黑素細(xì)胞以1 × 104個(gè)/孔接種96孔板，每孔100 μl。按上述方法分組給藥處理48 h，每濃度組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。PBS清洗 3 遍后，每孔加入 1%TritonX-100 溶液 90 μl。將培養(yǎng)板于-80 ℃冰箱中放置30 min，置于室溫融化。配制0.1%左旋多巴溶液，每孔加入100 μl。于培養(yǎng)箱放置2 h，用酶標(biāo)儀測定490 nm 處A值。酪氨酸酶活性以A490表示。

7.NaOH 溶解法檢測黑素含量：將黑素細(xì)胞以1×105個(gè)/皿的濃度接種入直徑6 cm 培養(yǎng)皿，按上述方法分組給藥處理48 h 后每皿加1 mol/L NaOH溶液1 ml，置于培養(yǎng)箱中溶解黑素12 h。將皿中的液體轉(zhuǎn)移至96 孔板，各濃度組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔加 100 μl 裂解液。用酶標(biāo)儀測定 405 nm 處A值。黑素含量以（藥物處理組A405/對照組A405）×100%表示。

8.Western印跡檢測黑素細(xì)胞定向發(fā)育及黑素合成相關(guān)蛋白MITF、TYR、TYRP1 的表達(dá)：將黑素細(xì)胞以1×105個(gè)/皿種入直徑6 cm培養(yǎng)皿。按上述方法分組給藥處理48 h 后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂 解 液 冰 浴 0.5 h 提 取細(xì)胞總蛋白。4 ℃、12 000×g離心10 min 后取上清液，用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定后將所提取蛋白進(jìn)行熱變性處理。行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入1∶1 000 稀釋的 MITF、TYR、TYRP1 和 β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜后加入1∶2 000 稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜。加入ECL 超敏顯影劑顯色曝光，用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值進(jìn)行歸一化處理，比較各組蛋白的表達(dá)量。

9.Masson-Fontana 黑素染色：將黑素細(xì)胞以5×104個(gè)/孔濃度種入6孔板，按上述方法分組給藥處理48 h 后每孔加4%多聚甲醛溶液1 ml，室溫固定20 min。用蒸餾水輕吹洗滌后靜置3 min，重復(fù)3遍。用Masson-Fontana黑素染色液按照試劑說明對黑素細(xì)胞進(jìn)行染色后，鏡下觀察。

10.熒光定量 PCR 檢測 MITF、TYR 和 TYRP1 mRNA 的表達(dá)：黑素細(xì)胞以 5 × 104個(gè)/孔種入 6 孔板，按上述方法分組處理48 h后用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，參照TaKaRa 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA 并進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見表1。用MxPro QPCR 軟件獲得代表熒光強(qiáng)度的Ct 值，Ct 目的基因-Ct內(nèi)參基因 = ΔCt，ΔCt給藥組樣本-ΔCt對照樣本 = ΔΔCt，用2-ΔΔCt代表mRNA的相對表達(dá)量。

11.統(tǒng)計(jì)分析：定量資料用單因素方差分析法（ANOVA）和LSD-t檢驗(yàn)法分別進(jìn)行多組間比較及組間兩兩多重比較，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 6.0繪制統(tǒng)計(jì)圖。

結(jié) 果

1.拉坦前列素對黑素細(xì)胞增殖的影響：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素組及對照組間細(xì)胞增殖水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024）。10-6、10-5mol/L拉坦前列素組均顯著高于對照組（均P＜0.05），但這兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 0.164，P=0.873）。10-7mol/L 拉坦前列素組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.23）。見表2。

2.拉坦前列素對酪氨酸酶活性的影響：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素組及對照組間酪氨酸酶活性各不相同（P=0.002），10-6、10-5mol/L拉坦前列素組均顯著高于對照組（P＜0.05），這兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.200，P=0.059）。10-7mol/L 拉坦前列素組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.063）。見表2。

表1 熒光定量PCR法所用引物序列（5′-3′）

表2 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成的影響

3.拉坦前列素對黑素含量的影響：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素組及對照組間黑素合成量各不相同（P=0.000 3），10-6、10-5mol/L 拉坦前列素組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.264，P=0.242），但這兩組均顯著高于對照組（P＜ 0.01）。而10-7mol/L 拉坦前列素組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.077）。見表2。

Masson-Fontana 染色顯示，各濃度拉坦前列素組黑素細(xì)胞樹突上的黑素顆粒均較對照組數(shù)量更多、顏色更深，且隨拉坦前列素濃度的升高，黑素顆粒的顯色從淡棕色加深至黑褐色。見圖1。

4.拉坦前列素對黑素細(xì)胞關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)的影響：見圖2。各組MITF、TYR、TYRP1 mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為112.594、99.051、342.301，均P＜ 0.01）。10-7mol/L拉坦前列素組MITF mRNA 的表達(dá)顯著高于對照組（t=3.905，P＜ 0.01）、低于10-6mol/L 拉坦前列素組（t=5.710，P＜ 0.01），10-6mol/L組顯著低于10-5mol/L拉坦前列素組（t=7.652，P＜ 0.01），即MITF的表達(dá)呈濃度依賴。

圖1 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細(xì)胞合成黑素的影響（Masson-Fontana染色×200） 1A：對照組，不加拉坦前列素的培養(yǎng)基組；1B：10-7 mol/L拉坦前列素組；1C：10-6 mol/L拉坦前列素組；1D：10-5 mol/L拉坦前列素組。隨拉坦前列素濃度的升高，黑素細(xì)胞樹突上的黑素顆粒數(shù)量增多，黑素顆粒的顯色從淡棕色加深至黑褐色

10-6mol/L 拉坦前列素組TYR mRNA 的表達(dá)顯著高于對照組、10-7、10-5mol/L拉坦前列素組（t= 16.475、12.111、7.516，均P＜ 0.01），且 10-7、10-5mol/L 拉坦前列素組亦高于對照組（t= 4.391、8.958，均P＜ 0.01）。

10-6mol/L 拉坦前列素組TYRP1 mRNA 的表達(dá)顯著高于對照組、10-7、10-5mol/L 拉坦前列素組（t= 23.846、24.281、3.013，均P＜0.05），10-5mol/L 拉坦前列素組顯著高于對照組（t= 20.833，P＜ 0.01），而10-7mol/L拉坦前列素組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 0.435，P=0.675）。

5.拉坦前列素對黑素合成關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)的影響：見圖3。4 組間MITF、TYR、TYRP1 蛋白表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為30.785、28.371、133.788，均P＜ 0.01）。

圖2 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細(xì)胞小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）mRNA 表達(dá)的影響 1：對照組，不加拉坦前列素的培養(yǎng)基組；2：10-7 mol/L 拉坦前列素組；3：10-6 mol/L 拉坦前列素組；4：10-5 mol/L拉坦前列素組。MITF的表達(dá)隨拉坦前列素濃度升高而增加，TYR、TYRP1的表達(dá)在10-6 mol/L拉坦前列素組最高。n=3。a：與對照組相比，P ＜ 0.01

圖3 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細(xì)胞小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）蛋白表達(dá)的影響 3A：Western印跡檢測蛋白表達(dá)電泳圖；3B ～3D：各組黑素細(xì)胞MITF、TYR、TYRP1蛋白表達(dá)水平柱形圖。1：對照組；2 ～4：分別為10-7、10-6、10-5 mol/L拉坦前列素組。MITF的表達(dá)隨拉坦前列素濃度升高而增加，TYR、TYRP1的表達(dá)在10-6 mol/L拉坦前列素組最高。n=3。與對照組相比，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01

10-6、10-5mol/L拉坦前列素組MITF蛋白表達(dá)量均顯著高于對照組（t值分別為7.082、8.611，均P＜0.01）和10-7mol/L 拉坦前列素組（t值分別為7.082、4.149、5.679，均P＜ 0.01），但10-6與10-5mol/L 拉坦前列素組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.530，P=0.165），10-7mol/L 拉坦前列素組高于對照組（t=2.932，P=0.019）。

10-6mol/L 拉坦前列素組TYR 蛋白的表達(dá)顯著高于對照組和10-7、10-5mol/L 拉坦前列素組（t值分別為7.567、8.125、3.884，均P＜ 0.01），10-5mol/L 拉坦前列素組顯著高于對照組（t=3.683，P＜ 0.01），而10-7mol/L拉坦前列素組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.557，P=0.592）。

10-6mol/L 拉坦前列素組TYRP1蛋白的表達(dá)顯著高于對照組、10-7、10-5mol/L拉坦前列素組（t值分別為16.161、6.562、17.135，均P＜ 0.01），10-7拉坦前列素組顯著高于對照組（t= 9.599、P＜ 0.01），而10-5mol/L 拉坦前列素組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.974，P=0.358）。

討 論

拉坦前列素作為眼科外用藥，導(dǎo)致患者虹膜、睫毛及眶周皮膚顏色加深的現(xiàn)象引起了學(xué)者的注意[12-13]。在確定此類色素沉著對眼功能及眼周皮膚無不良影響后，研究者針對拉坦前列素在色素脫失性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行了一些臨床研究[3-6]，發(fā)現(xiàn)單用拉坦前列素治療白癜風(fēng)，可取得較好的復(fù)色效果，將其分別與窄譜UVB（NB-UVB）、微針、Fraxel點(diǎn)陣激光和UVA 光療聯(lián)合治療時(shí)，復(fù)色效果更為顯著。

體外研究顯示[14-16]，拉坦前列素可誘導(dǎo)酪氨酸酶轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)酪氨酸酶活性，從而促進(jìn)虹膜黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞的黑素合成。為探究拉坦前列素對皮膚色素脫失性疾病的治療前景，我們探討拉坦前列素體外對人表皮黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的影響，結(jié)果顯示，10-6、10-5mol/L 拉坦前列素可以促進(jìn)人源表皮黑素細(xì)胞的增殖，并能顯著刺激酪氨酸酶活性增加和黑素合成。表明拉坦前列素或可通過酪氨酸酶相關(guān)代謝途徑誘導(dǎo)黑素合成。

黑素生成過程受多重因素調(diào)控，MITF 可調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞的定向分化和細(xì)胞周期進(jìn)展，參與黑素細(xì)胞分裂和黑素化，控制色素生成限速酶相關(guān)基因TYR、TYRP1等的表達(dá)，是黑素細(xì)胞發(fā)育存活、黑素生成功能的主要調(diào)節(jié)者[17]。MITF、TYR、TYRP1 的表達(dá)缺失會(huì)引起酪氨酸酶活性降低，減少黑素合成，造成皮膚色素脫失[18]。多種針對色素脫失性疾病的治療研究[19-21]均以MITF、TYR、TYRP1 為治療靶點(diǎn)，因此我們對上述3種因子從mRNA及蛋白水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，拉坦前列素能不同程度促進(jìn)MITF、TYR、TYRP1 mRNA 及蛋白的表達(dá)，其中MITF 表達(dá)的升高呈濃度依賴性，而TYR 和TYRP1的表達(dá)在10-6mol/L 拉坦前列素組最高。同時(shí)，酪氨酸酶活性與黑素合成水平也在10-6、10-5mol/L 濃度的藥物處理后顯著升高，故我們認(rèn)為適宜濃度的拉坦前列素可能通過促進(jìn)MITF、TYR、TYRP1 的mRNA 和蛋白表達(dá)對人表皮黑素細(xì)胞的生物活性產(chǎn)生促進(jìn)作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)拉坦前列素對MITF、TYR、TYRP1 的促進(jìn)作用并不平行，提示藥物可能通過多種機(jī)制影響黑素細(xì)胞TYR、TYRP1的表達(dá)，而非僅通過MITF-TYR 軸，即影響旁枝通路從而導(dǎo)致上游MITF 與下游TYR、TYRP1 基因表達(dá)受藥物濃度的影響不一致。此外，已測得拉坦前列素在人表皮黑素細(xì)胞中IC50值為8.8×10-5mol/L，拉坦前列素對TYR、TYRP1的表達(dá)及黑素細(xì)胞活性的作用或受較高濃度的影響。不可排除的是，此結(jié)果可能受實(shí)驗(yàn)條件質(zhì)控的影響，想要論證此藥是否為白癜風(fēng)治療的有效、可靠藥物，需進(jìn)行更充分與深入的研究。

綜上所述，本研究初步證實(shí)拉坦前列素可促進(jìn)人正常黑素細(xì)胞增殖，并可能通過上調(diào)MITF、TYR、TYRP1 mRNA和蛋白水平促進(jìn)酪氨酸酶活性和黑素合成。

因研究水平及條件所限，本研究存在一定的不足和局限性。本實(shí)驗(yàn)的研究對象是正常的人表皮黑素細(xì)胞，如欲將拉坦前列素應(yīng)用于白癜風(fēng)患者患者的治療，選擇患者皮損處提取的表皮黑素細(xì)胞進(jìn)行給藥實(shí)驗(yàn)意義更大。此外，應(yīng)用白癜風(fēng)動(dòng)物模型進(jìn)一步探索會(huì)對拉坦前列素長期用藥的有效性、耐藥性及安全性的驗(yàn)證有更大幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突