謝文敏

【摘要】目的：通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法構建對大鼠血漿中紫杉醇濃度的檢測。方法：使用克拉霉素溶液作為內(nèi)標物，大鼠血漿樣品通過乙腈溶液處理后，進行HPLC-MS檢測。結論：本實驗利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡稱為HPLC-MS）對血漿中紫杉醇濃度進行檢測，具有檢測速度快、檢測靈敏度高的特點，能夠實現(xiàn)臨床治療過程中的檢測要求。

【關鍵詞】紫杉醇;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

【中圖分類號】R123【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-6851（2019）06-252-01

0 引言

紫杉醇，又叫泰素，其化學結構在1971年被確定，是一種四環(huán)二萜類化合物。它是一種良好的抗腫瘤藥物，當腫瘤細胞發(fā)生分裂時，它可以和微觀蛋白發(fā)生聚合作用，從而阻礙腫瘤細胞進行有絲分裂的過程，使得腫瘤細胞停止生長。通過相關的臨床試驗結果表明，紫杉醇在許多腫瘤類疾病，例如：卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、肺部腫瘤、淋巴腫瘤等，具有一定的治療效果。因此，對血漿中紫杉醇濃度進行檢測這一項目有著重要的現(xiàn)實意義[1]。

通過相關文獻調(diào)研，我們藥廠發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外科研工作者主要利用反相高效液相色譜法對血漿中紫杉醇濃度進行檢測，但是反相高效液相色譜法存在對樣品檢測的靈敏度較低、操作流程不簡潔以及檢測時間較長等問題[2-3]。因此，我們藥廠利用了一種檢測速度快、檢測靈敏度高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡稱為HPLC-MS）對血漿中紫杉醇濃度進行檢測，現(xiàn)給出我們藥廠的檢測報告如下：

1 實驗部分

1.1 藥品

我們藥廠以對照品紫杉醇，其含量為99.5%作為檢測試樣;以對照品克拉霉素，其含量為99.9%作為內(nèi)標物。其他全部藥品為分析純。

1.2 儀器

我們藥廠采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，具體型號為Agilent 1100 LC/MSD SL，同時，為這臺儀器配置電噴霧離子化電離源（ESI）;還采用高溫低速離心機，具體型號為Eppendorf 5427 R，來自于美國Eppendorf公司。

1.3 實驗對象

我們藥廠利用四只雄性的大鼠作為研究對象，大鼠均來自于動物繁殖場，大鼠質(zhì)量約為（230 ± 20）克。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

高效液相色譜的色譜柱為2.1毫米 × 150毫米，5微米;高效液相色譜的流動相為甲醇和0.05%甲酸水溶液，其體積比為70 ： 30;高效液相色譜的流動速度為每分鐘0.2毫升;高效液相色譜的柱溫為25 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜法所采用的離子源為電噴霧離子化電離源（ESI），其中霧化氣壓為20 Pa，氣體流動速度為每分鐘10.0毫升，溫度為350 ℃。通過正離子的方式檢測，從理論上來說，紫杉醇的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為 m/z = 876.5 [M + Na]+，而克拉霉素的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為m/z = 748.6 [M + H]+。

2.3 大鼠血漿樣品的處理

我們量取0.2毫升的大鼠血漿，向其中加入10微升的內(nèi)標物克拉霉素溶液，將兩者混合均勻;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過高速離心機離心10分鐘，離心機的轉速為每分鐘2000轉;隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進行檢測。

2.4 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜儀通過正離子的方式檢測的情況下，紫杉醇通常會產(chǎn)生[M + Na]+的分子離子峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)為 m/z = 876.5;內(nèi)標物克拉霉素通常會產(chǎn)生[M + H]+ 的分子離子峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)為 m/z = 748.6，因此在對樣品做定量分析時，我們要選擇性檢測出上述分子離子峰。

2.5 方法學研究

2.5.1 配制標準溶液 對于紫杉醇標準溶液的配制，首先，使用精密度較高的分析天平稱量0.0120克紫杉醇標準物質(zhì)，將其溶解在甲醇溶液中，再使用10毫升的容量瓶對上述溶液進行定容。當進行相關的實驗時，可以通過將上述溶液稀釋成不同濃度來進行實驗。

對于內(nèi)標物克拉霉素標準溶液的配制，首先，使用精密度較高的分析天平稱量0.0121克克拉霉素內(nèi)標物的標準物質(zhì)，將其溶解在甲醇溶液中，再使用10毫升的容量瓶對上述溶液進行定容。當進行相關的實驗時，可以通過將上述溶液稀釋成不同濃度來進行實驗。

2.5.2 方法專屬性

量取0.2毫升的大鼠血漿，向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過高速離心機離心10分鐘，離心機的轉速為每分鐘2000轉;隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進行檢測。

量取0.18毫升的大鼠血漿，向其中加入10微升的內(nèi)標物克拉霉素溶液和20微升的一定濃度的紫杉醇溶液，將兩者混合均勻;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過高速離心機離心10分鐘，離心機的轉速為每分鐘2000轉;隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進行檢測。

上述結果表明，紫杉醇的保留時間為2.0分鐘，而克拉霉素的保留時間為2.5分鐘，與此同時，在空白血漿的樣品中，其內(nèi)源性物質(zhì)不影響實驗的測試結果，包括紫杉醇的保留時間與克拉霉素的保留時間測定。這樣的結果表明，該方法有比較高的專屬性。

2.5.3 標準曲線制備

量取0.18毫升的大鼠血漿，向其中加入10微升的內(nèi)標物克拉霉素溶液和20微升的一定濃度的紫杉醇溶液，其中選取的紫杉醇濃度分別為每毫升7.5納克， 15.0納克， 60.0納克， 150.0納克， 300.0納克， 600.0納克， 1200.0納克， 6000.0納克），向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過高速離心機離心10分鐘，離心機的轉速為每分鐘2000轉;隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進行檢測，對色譜圖進行記錄，繪制出檢測物濃度（以此為橫坐標）與檢測物和內(nèi)標物的峰面積比值（以此為縱坐標）的曲線圖，通過最小二乘法對上述數(shù)據(jù)使用回歸計算，得到的線性回歸方程為 Y = 1.7089 C + 0.0069，其中相關系數(shù)r = 0.9999，對應獲得的紫杉醇的線性范圍在7.5到6000.0 納克/毫升之間，定量限在7.5納克/毫升。

2.5.4 回收率及精密度檢測

量取大鼠血漿，向其中加入一定量紫杉醇溶液，配制成多份濃度為15納克/毫升、300納克/毫升、6000納克/毫升的紫杉醇血漿溶液，再向其中加入10微升的內(nèi)標物克拉霉素溶液，將兩者混合均勻;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過高速離心機離心10分鐘，離心機的轉速為每分鐘2000轉;隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進行檢測，通過任意標準曲線計算回收率。每天平行做五次實驗，隔一天再平行做5次實驗，將其統(tǒng)計為日內(nèi)精密度與日間精密度和回收率，見表1所示。

2.5.5 穩(wěn)定性檢測

對于溶液的穩(wěn)定性來說，選取相同的溶液進行檢測，檢測時間分別為直接檢測、一小時、四小時、八小時、十二小時與二十四小時，對溶液血漿濃度進行計算，RSD的數(shù)值為1.01%，表明在二十四小時以內(nèi)該溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

對于溶液的冷融穩(wěn)定性來說，選取三個樣品進行檢測，其濃度分別為低濃度、中濃度和高濃度，把三個樣品放置于零下20 ℃中，檢測時間分別為直接檢測、一天、三天、七天與十四天，對溶液血漿濃度進行計算，得到的低濃度、中濃度和高濃度的RSD的數(shù)值為7.17%、5.63%、2.10%，表明在冷藏十四天以內(nèi)該溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

3 結論

本實驗利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡稱為HPLC-MS）對血漿中紫杉醇濃度進行檢測，具有檢測速度快、檢測靈敏度高的特點，能夠實現(xiàn)臨床治療過程中的檢測要求[4]。

參考文獻：

[1]李天雪，胡玉濤，陳如洋， 褚朝森.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定大鼠血漿中阿帕替尼與紫杉醇[J].分析測試學報， 2018， 4（37）： 477～481.

[2]陳華，吳筱丹，許東航，徐翔.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿紫杉醇濃度[J].醫(yī)藥導報， 2007， 7（26）： 734～736.

[3]陳小歡，許杜娟，夏泉，等.反相高效液相色譜法測定人血漿中紫杉醇的濃度[J].安徽醫(yī)藥， 2012，16（1）：35-37.

[4]劉韜，黃紅兵，林子超，等.高效液相色譜法測定人血漿中多西紫杉醇濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2007， 27（7）：897-899.