王梨明 范志浩 范曉麗 王 娟 王銳英 辛林偉 唐際存

(1 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨二科，廣西桂林市 541001，電子郵箱:fxl911@126.com；2 廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院輔助生殖科，桂林市 541002；3 桂林醫(yī)學院科學實驗中心，廣西桂林市 541004)

骨肉瘤是導致兒童癌癥死亡的最常見腫瘤，組織學表現(xiàn)為惡性間葉細胞的骨樣生成，局部具有侵襲性并易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]。目前，骨肉瘤主要以手術(shù)治療為主，輔以化療。由于化療藥物常對正常組織具有高毒性，容易導致貧血、中性粒細胞減少癥、血小板減少癥、心臟損傷和其他一系列不良反應，從而降低患者的生存率[3-4]。因此，尋找高效低毒的抗癌活性成分，對于改善骨肉瘤的臨床療效和預后具有重要的意義。甘草查爾酮A(licochalcone A，LCA)從常用中藥-甘草中提取而來，是一種具有多重藥理活性的黃酮類化合物，其抗腫瘤活性最受關(guān)注[5]。近年來，有研究顯示LCA對多種腫瘤細胞如胃癌[6]、肺癌等[7]，都有明顯的抑制作用，但對骨肉瘤細胞的作用尚不清楚。本研究旨在探討LCA對人骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制，以期為LCA抗腫瘤的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人骨肉瘤細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 LCA(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：P21O8F46473)。杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；美國Gibco公司，批號：8117182)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma公司，批號：D8418)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：20171012)，胰蛋白酶(Solarbio公司,批號：20170611)，噻唑藍(南寧市博美生物科技有限公司，批號：K190622)，膜連蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate,Annexin Ⅴ-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司,批號：556547)，B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)單克隆抗體(Abcam公司,批號：ab182858、ab32503)，β-肌動蛋白單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：15041)，兔二抗(依瑪博科技有限公司，批號：171201)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組：用含10%胎牛血清及1%雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人骨肉瘤細胞。用DMSO將LCA配制成80 mmol/L的原液，使用前用培養(yǎng)基稀釋。實驗分為空白組(LCA濃度為0 μmol/L)以及4個實驗組(LCA終濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)。

1.3.2 噻唑藍法測定細胞增殖：將人骨肉瘤細胞接種于96孔板中，細胞濃度為1×105個細胞/mL，每孔200 μL細胞懸液，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后每組加入終濃度分別為0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的LCA，每組設(shè)5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μL噻唑藍溶液，繼續(xù)孵育4 h后棄孔內(nèi)液體。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，讀取酶標儀(瑞士Tecan公司,Infinite M200 Pro型)490 nm波長處A值，實驗重復3次。細胞增殖抑制率=(1-A藥物組/A空白組)×100%。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：將人骨肉瘤細胞接種于6孔板中，每組分別加入終濃度分別為0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的LCA處理48 h后，收集細胞，加入稀釋好的結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶各5 μL，室溫避光孵育20 min，過濾后用流式細胞儀(美國BD公司,C6plus型)檢測。

1.3.4 蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達情況：取對數(shù)期人骨肉瘤細胞，按照實驗分組加入LCA，藥物作用48 h后收集人骨肉瘤細胞，RIPA裂解液充分裂解，用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，取等量蛋白進行電泳分離，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應的一抗(1 ∶1 000)(Bcl-2、Bax和β-肌動蛋白)，4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜，之后二抗(1 ∶2 000)孵育1 h,以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，用Gel-Pro軟件對蛋白條帶進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，重復測量資料采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 5組人骨肉瘤細胞增殖抑制率的比較 5組細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義(F組間=361.539，P組間<0.001)，各LCA組的抑制率均高于空白組，且隨著藥物作用濃度的增加，抑制率逐漸增高(均P<0.05)；抑制率有隨時間增加的趨勢(F組間=622.467，P組間<0.001)；時間與分組之間有交互作用(F交互=43.372，P交互<0.001)。見表1。

表1 5組人骨肉瘤細胞增殖抑制率的比較(x±s，%)

2.2 5組人骨肉瘤細胞凋亡率比較 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LCA組的細胞凋亡率均高于空白組(均P<0.05)。LCA濃度為10～40 μmol/L時，細胞凋亡率隨著藥物濃度增加而升高(均P<0.05)。見表2。

表2 5組人骨肉瘤細胞凋亡率比較(x±s,%)

注：與空白組比較，*P<0.05；與10 μmol/L LCA組比較，#P<0.05；與20 μmol/L LCA組比較，▲P<0.05。

2.3 5組人骨肉瘤細胞Bcl-2和Bax蛋白表達水平的比較 與空白組相比，20 μmol/L、40 μmol/L LCA組Bcl-2蛋白表達降低，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LCA組Bax蛋白表達升高。見圖1及表3。

圖1 5組人骨肉瘤細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達水平比較

注：a、b、c、d、e分別為空白組、5 μmol/L LCA組、10 μmol/L LCA組、20 μmol/L LCA組、40 μmol/L LCA組。

表3 5組HOS細胞Bcl-2和Bax蛋白表達比較

注：與空白組比較，*P<0.05。

3 討 論

骨肉瘤是高發(fā)于兒童和青少年的骨組織惡性腫瘤，患者預后差，死亡率高。LCA來源于中國傳統(tǒng)中藥甘草，具有抗炎[8]、抗氧化[9]等多種藥理學活性，近年來，有不少學者對LCA的抗腫瘤作用進行研究，但是其對骨肉瘤作用的研究較少，而且具體的作用機制尚不明確。本研究旨在探討LCA對人骨肉瘤細胞增殖及凋亡的影響，并探究其可能的分子機制。

本研究結(jié)果顯示，各LCA組人骨肉瘤細胞增殖抑制率均高于空白組，且隨著藥物作用濃度的增加，抑制率逐漸增加，LCA組的抑制率均有隨時間增加的趨勢(均P<0.05)，提示經(jīng)LCA處理后人骨肉瘤細胞的增殖受到明顯抑制，且呈濃度及時間依賴性。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LCA組的細胞凋亡率均高于空白組(均P<0.05)，提示LCA可以有效促進細胞的凋亡，且LCA濃度為10～40 μmol/L時，細胞凋亡率亦呈濃度依賴性。

細胞凋亡通路主要有4條，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、線粒體通路、死亡受體表達通路以及B粒酶通路[10]，其中細胞凋亡抑制基因Bcl-2蛋白家族作用位點主要在線粒體外膜上[11]。Bcl-2是研究最早的抗凋亡因子，其主要功能是抑制細胞凋亡、促進細胞存活，而Bax基因可加速細胞凋亡。研究表明，Bcl-2家族成員的構(gòu)成比是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵，尤其Bcl-2/Bax是啟動細胞凋亡的“分子開關(guān)”[12]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，LCA處理組Bax蛋白的表達水平升高，而Bcl-2蛋白的表達水平降低(P<0.05)。提示LCA可能通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白的表達，促進骨肉瘤細胞的凋亡。

綜上所述，LCA可以抑制細胞增殖，呈濃度及時間依賴性，并誘導細胞凋亡，在一定的干預濃度范圍內(nèi)亦呈濃度依賴性，其機制可能與上調(diào)Bax蛋白表達和下調(diào)Bcl-2蛋白表達有關(guān)，這為骨肉瘤的臨床治療提供了必要的理論依據(jù)。此外，值得注意的是，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多途徑的過程，分子機制復雜，因此應用LCA治療骨肉瘤仍需進一步的研究。