趙潤(rùn)晨，徐軍，王婧怡，袁中旭，李琰，鄔彩霞

（江蘇省揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 揚(yáng)州市 225009）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年會(huì)使用大量的化學(xué)試劑防治雜草。近年來(lái)，環(huán)境問(wèn)題日益受到人們關(guān)注，生物除草劑的應(yīng)用可有效緩解化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境問(wèn)題。一些化感物質(zhì)的作用方式和作用效果和市面上的化學(xué)除草劑十分相似，這使得它們有可能在將來(lái)成為新的雜草管理的重要手段。近年來(lái)，許多科研工作者開(kāi)展了這方面的研究。王海斌等[1]連續(xù)3 a的田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的化感水稻田間的抑草效果85%～92%，雖然相比于用化學(xué)除草的產(chǎn)量下降，但產(chǎn)品質(zhì)量顯著提高，成本也大大降低；蠶豆（Vicia faba）植株浸提液能抑制白三葉（Trifolium repens）、紫花苜蓿（Medicago sativa）以及多花黑麥草的發(fā)芽和生長(zhǎng)[2]；在田間噴灑芥菜（Brassica juncea）的水提物能夠顯著抑制多種雜草的生長(zhǎng)[3]。

黃花草木樨（Melilotus officinalis）是抗逆性很強(qiáng)的豆科牧草，主要分布于東北、華北、西北、西藏、四川及長(zhǎng)江流域以南的各個(gè)省份，具有很強(qiáng)的化感作用。汪之波[4]等用黃花草木樨水浸提液處理蒲公英（Taraxacum mongolicum）、馬齒莧（Portulaca oleracea）及巴天酸膜（Rumex patien-tia） 3種雜草，發(fā)現(xiàn)對(duì)這3種雜草種子的萌發(fā)和萌發(fā)后根苗的生長(zhǎng)有顯著影響；本課題組的前期研究[5]表明，黃花草木樨水浸提液能夠顯著抑制藜（Chenopodium album）、籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus）、車(chē)前草 （Plantago asiatica）、稗草（Echinochloa crus-galli）以及山苦荬（Ixeris chinensis）等種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)；春、秋季在田間施用黃花草木樨干草粉，發(fā)現(xiàn)單位面積雜草數(shù)量顯著降低，驗(yàn)證了黃花草木樨田間抑草效果。本課題組的前期研究還發(fā)現(xiàn)，黃花草木樨的主效化感物質(zhì)為香豆素[6]。

香豆素作為重要的化感物質(zhì)擁有很大的化感抑草潛力，是雜草防治的重要研究方向，但目前關(guān)于香豆素化感作用的研究主要停留于室內(nèi)生物檢測(cè)法。為了貼近生產(chǎn)實(shí)踐，本次采用盆栽實(shí)驗(yàn)，為開(kāi)發(fā)香豆素新型生物除草劑提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)品香豆素購(gòu)于SIGMA公司。多花黑麥草種子購(gòu)于百綠集團(tuán)。盆栽土壤為0～20 cm的表層耕作土壤，采集于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)田。栽培容器是直徑25 cm、高16.5 cm的塑料花盆。

1.2 試驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)玻璃溫室中進(jìn)行，將多花黑麥草種子播于塑料花盆中，每盆土質(zhì)量為3.5 kg。多花黑麥草出土15 d后向土壤均勻澆灌不同濃度香豆素溶液，濃度分別為100 mg/kg、200 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg和2 000 mg/kg（香豆素質(zhì)量/土壤質(zhì)量）。處理20 d后采集樣品測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

（1）植株全長(zhǎng)：各處理隨機(jī)取10株完整的多花黑麥草，測(cè)定從根基部到植株頂端，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)[7]。

（2）鮮重：各處理隨機(jī)取10株完整的多花黑麥草，將根系洗凈，用濾紙吸干根系表面的水分后稱(chēng)量，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)[7]。

（3）干重：將上述植株稱(chēng)完后放入干燥箱在105℃條件下殺青0.5 h，并于75℃條件下烘干至恒重，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)[7]。

（4）葉綠素：采用95%乙醇浸提法[8]提取，用分光光度計(jì)測(cè)定葉片葉綠素含量。

（5）可溶性糖：采用蒽酮比色法[7]測(cè)定多花黑麥草中可溶性糖（SS）的含量。

（6）脯氨酸：采用茚三酮比色法[7]測(cè)定多花黑麥草中脯氨酸（PRO）的含量。

（7）丙二醛：采用硫代巴比妥酸法[9]測(cè)定多花黑麥草中丙二醛（MDA）的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的處理采用Excel軟件完成，差異顯著性分析采用SPSS19軟件完成。

2 結(jié)果和分析

2.1 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草致死率的影響

從圖1可以看出，100 mg/kg的致死率為14.29%，200 mg/kg的致死率為34.41%，500 mg/kg的致死率為54.19%，1 000 mg/kg的致死率為74.31%，2 000 mg/kg的致死率為83.81%。致死率隨著香豆素濃度的升高而逐漸增加。

圖1 香豆素水溶液處理下多花黑麥草致死率的變化

2.2 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草植株全長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，不同濃度香豆素水溶液處理多花黑麥草幼苗后，其長(zhǎng)度均隨著處理濃度的升高而減小，且長(zhǎng)度均與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）。0～200 mg/kg濃度處理下長(zhǎng)度植株長(zhǎng)度顯著性下降（P＜0.05），200～2 000 mg/kg濃度處理下長(zhǎng)度雖下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 香豆素水溶液處理下多花黑麥草植物株長(zhǎng)的變化

2.3 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草植株鮮重、干重的影響

從圖3可以看出，不同濃度香豆素水溶液處理多花黑麥草幼苗后，其鮮重、干重均隨著處理濃度的升高而減小，且均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。鮮重在100～1 000 mg/kg濃度范圍內(nèi)不存在顯著性差異（P＞0.05），但該濃度區(qū)間處理顯著低于對(duì)照，顯著高于2 000 mg/kg濃度處理（P＜0.05）；干重在100～500 mg/kg濃度范圍內(nèi)不存在顯著性差異（P＞0.05），但該濃度區(qū)間處理顯著高于1 000 mg/kg和2 000 mg/kg濃度處理。

圖3 香豆素水溶液處理下多花黑麥草鮮重、干重的變化

2.4 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草植株葉綠素的影響

從圖4可以看出，不同濃度香豆素水溶液處理多花黑麥草幼苗后，葉綠素含量隨濃度升高呈下降趨勢(shì)，低濃度（100 mg/kg、200 mg/kg） 葉綠素含量與對(duì)照的差異不顯著（P＞0.05），在中、高濃度（500 mg/kg、1 000 mg/kg、2 000 mg/kg）處理下葉綠素含量顯著降低（P＜0.05）。

圖4 香豆素水溶液處理下多花黑麥草葉綠素含量的變化

2.5 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草植株可溶性糖（SS）的影響

從圖5可以看出，不同濃度香豆素水溶液處理多花黑麥草幼苗后，SS含量呈先升高后降低趨勢(shì)，低、中濃度（100 mg/kg、200 mg/kg、500 mg/kg）處理下，SS含量與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），高濃度（1000mg/kg、2000 mg/kg）處理下與對(duì)照差異不顯著。其中，100mg/kg濃度處理下SS含量達(dá)到最大值。

圖5 香豆素水溶液處理下多花黑麥草可溶性糖含量的變化

2.6 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草植株脯氨酸（PRO）的影響

從圖6可以看出，不同濃度香豆素水溶液處理多花黑麥草幼苗后，脯氨酸（PRO）含量均高于對(duì)照，其中，低、中濃度（100 mg/kg、200 mg/kg、500 mg/kg）處理與對(duì)照有顯著性差異（P＜0.05）。在200 mg/kg濃度處理下，脯氨酸含量達(dá)到最大值，而后濃度越高其含量越低。

圖6 香豆素水溶液處理下多花黑麥草PRO含量的變化

2.7 香豆素水溶液對(duì)多花黑麥草植株丙二醛（MDA）的影響

從圖7可以看出，不同濃度香豆素水溶液處理多花黑麥草幼苗后，MDA含量整體隨濃度增加呈升高趨勢(shì)，中、低濃度（100 mg/kg、200 mg/kg）處理組之間差異不顯著（P＞0.05），中、高濃度（1 000 mg/kg、2 000 mg/kg）處理組之間也不存在顯著性差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，低濃度處理組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），與高濃度組相比，低濃度組顯著低于高濃度處理組（P＜0.05）。

圖7 香豆素水溶液處理下多花黑麥草MDA含量的變化

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在香豆素水溶液處理下，多花黑麥草幼苗根基部呈暗黃色且易斷，葉尖枯黃，隨著濃度的升高，葉片顏色加深，葉基部和葉尖壞死，致死率也逐漸升高，尤其施用中、高濃度時(shí)，致死率達(dá)到50%以上。可見(jiàn)香豆素對(duì)多花黑麥草的作用是由根基部和葉尖向葉片中間擴(kuò)展，最終葉間部位壞死，植株死亡。植物在逆境脅迫下，碳同化量減少、滲透調(diào)節(jié)能耗和維持生長(zhǎng)能耗增加，使得植株生長(zhǎng)量和積累量減少[10]。各個(gè)香豆素水溶液均顯著抑制了多花黑麥草的長(zhǎng)度、鮮重和干重，這與周珩[11]等研究結(jié)果一致。

葉綠素是植物體進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)保障，葉綠素的合成是經(jīng)歷一系列生理生化反應(yīng)后的重要產(chǎn)物。植物在外界脅迫下，其內(nèi)部的代謝反應(yīng)過(guò)程會(huì)發(fā)生改變，光合色素的正常合成也會(huì)受到影響，植物組織內(nèi)部葉綠素的含量也隨之變化。因此，植物體組織中葉綠素含量的高低是判斷植物體生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)[12]。很多實(shí)驗(yàn)表明逆境脅迫會(huì)打破植物正常的新陳代謝，導(dǎo)致葉綠素含量下降[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香豆素水溶液顯著影響了多花黑麥草葉綠素的含量，也證實(shí)上述結(jié)論。在低濃度條件下，多花黑麥草幼苗具有一定的耐受力，葉綠素含量與對(duì)照差異不顯著，當(dāng)濃度達(dá)到500 mg/kg時(shí)，葉綠素含量極顯著下降。這可能有三方面的原因：一是香豆素脅迫引起植物體內(nèi)活性氧的增加，直接破壞了葉綠素分子；二是香豆素導(dǎo)致葉綠素酶活性增強(qiáng)，一定程度上使得葉綠素的分解速度加快；三是香豆素使與葉綠素相關(guān)的作用酶受到抑制作用或其中間產(chǎn)物合成減少[15]。

丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量水平表示脂質(zhì)過(guò)氧化程度和膜系統(tǒng)在相應(yīng)的條件下受到傷害的程度?？扇苄蕴牵⊿S）和游離脯氨酸（PRO）是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)植物遭受脅迫時(shí)，SS和PRO的含量會(huì)發(fā)生改變。因此，當(dāng)MDA、SS以及PRO含量出現(xiàn)變化時(shí)，表明植物體內(nèi)膜系統(tǒng)受到一定程度的破壞，植物的代謝系統(tǒng)也會(huì)出現(xiàn)紊亂[16]。許多研究表明，植物可通過(guò)提高體內(nèi)SS和PRO含量來(lái)抵御逆境脅迫[17-18]。本實(shí)驗(yàn)中，在低濃度香豆素水溶液處理下，多花黑麥草體內(nèi)SS和PRO含量升高，分別于100 mg/kg和200 mg/kg達(dá)到最大值，后隨濃度升高不斷降低，說(shuō)明多花黑麥草在低濃度處理下具有一定的抵御能力，但中、高濃度處理時(shí)，香豆素會(huì)破壞這種條件機(jī)制，導(dǎo)致SS和PRO含量降低。劉成[19]研究發(fā)現(xiàn)，加拿大一枝黃花在蘆葦葉水浸提液處理的過(guò)程中，丙二醛含量與蘆葦葉浸提液濃度呈正相關(guān)，即其含量的變化隨著濃度的增加而變高。本實(shí)驗(yàn)得出了相似的結(jié)果，反映出香豆素使多花黑麥草細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化作用，造成MDA含量增加，尤其是中、高濃度處理。