王榮榮，姜興旭，陳龍，朱靜

（信陽農林學院食品學院，河南 信陽 464000）

茶，被歷朝歷代的養(yǎng)生家、藥學家稱為“萬病之藥”，其藥用價值的歷史也十分悠久，是被世人公認的、天然的功能性飲料。從古至今，我國人民就有喝茶的良好習慣。綠茶，是未經發(fā)酵而直接制成的茶，其香氣純凈、口感柔和，含有500 多種有機化合物和26 種以上無機礦物質，還含有茶多酚、茶多糖和咖啡堿等功能成分和人體必需的蛋白質、氨基酸和維生素等，具有抗衰老、防癌、抗菌、抗輻射、消炎等特殊生理作用[1-2]。

茶酒是以茶葉和蔗糖為原料，經釀酒酵母發(fā)酵、過濾、澄清、陳釀而制成的酒精飲料。茶酒中含有豐富的氨基酸、維生素及茶多酚、咖啡堿等多種營養(yǎng)成分，日常適量飲用，可起到健胃生津、醒腦明目、改善代謝紊亂、增強機體免疫力等功效[3-8]。

對茶酒的研制與我國酒類研發(fā)的保健方向一致，既增加了市場上的酒類品種，又具有十分廣闊的發(fā)展前景。目前，李國勝等[9]、周丹丹等[10]、劉銳等[11]對茶酒發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，但并未進行動力學研究；李秀萍等[12]、靳夢楚等[13]、李雪等[14]、熊亞等[15]對甘蔗、火龍果、仙人掌果酒發(fā)酵動力學模型進行了研究，但都僅限于菌體生長、產物生成和底物消耗，研究均為酵母在果酒中的動力學。茶酒發(fā)酵動力學主要是采用數學模型來定量描述在發(fā)酵過程中的菌體濃度、底物濃度和產物濃度隨時間變化的規(guī)律，對于研究發(fā)酵工藝參數、優(yōu)化和控制過程操作具有十分重要的意義[16]。在目前的研究中，對于茶酒動力學尚未有相關文獻報道，本研究以信陽毛尖和蔗糖為原料，釀酒酵母為發(fā)酵菌株，對茶酒發(fā)酵過程中主要理化指標測定，進行茶酒發(fā)酵規(guī)律的研究，并構建其動力學模型，從而為優(yōu)質茶酒的開發(fā)和研制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

信陽毛尖、一級蔗糖：沃爾瑪超市；果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉：天津市巴斯夫化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子天平（FA2104）：上海良平儀器儀表有限公司；酒精計（0～100）：河北省武強縣同輝儀表廠；生化培養(yǎng)箱（SPX-250BIII）：北京科偉永興儀器公司；雙光束紫外可見分光光度計（TU1901）：北京普析通用儀器有限責任公司；pH 計（STARTER3C）：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

茶酒的制作工藝參考李建芳等[17]，略作調整。

茶葉與水按 1 ∶50（g/mL）在 90 ℃～95 ℃浸提 30 min，過濾，冷藏備用。糖度調整為17°Bx，pH 4.5，酵母接種量0.3%，活化后接種至茶湯中，24 ℃恒溫發(fā)酵13 d，每隔48 h 取樣檢測。

1.2.2 檢測方法

每隔1 d 測一次指標，每次都在固定時間取樣，按照相應的檢測方法檢測不同時期各個理化指標數值。以發(fā)酵時間為橫坐標，對應的理化指標為縱坐標，繪制出各理化指標隨時間的變化曲線。

1.2.2.1 酒精度的測定

參照GB/T15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計法。

1.2.2.2 總酸的測定

參照GB/T15038－2006 直接滴定法。

1.2.2.3 總糖的測定

參照GB/T15038－2006 直接滴定法。

1.2.2.4 酵母量的測定

采用干重法[18]：每次取酒液 20 mL，4 000 r/min，離心15 min，棄上清液，然后在恒溫干燥箱中干燥至恒重后稱重。

1.2.2.5 茶多酚的測定

依據《市場茶飲料中茶多酚含量的測定與分析》中的酒石酸亞鐵法[19]。

1.2.2.6 氨基酸的測定

采用甲醛中和滴定法[20]。

1.3 茶酒發(fā)酵動力學模型的建立及差異顯著性分析

試驗中做3 組平行試驗，取其平均值。菌體生長、產物生成、底物消耗的動力學模型的建立采用MATLAB 數據分析軟件進行分析，采用DPS 數據處理系統進行差異顯著性分析。

1.3.1 酵母菌生長動力學模型

Logistic 模型是一個非常典型的S 形曲線方程[21]，同時也是一個廣泛應用于擬合釀酒酵母生長的曲線模型，因而適合茶酒中菌體生長動力學的研究。李雪等[14]在仙人掌果酒發(fā)酵動力學研究中，用此模型擬合酵母菌生長。方程如下：

上式兩邊積分得：

式中：X 為菌體量，g；μm為最大比生長速率，h-1；Xm為最大菌體量，g；X0為初始菌體量，g；t 為發(fā)酵時間，h。

1.3.2 酒精度生成動力學模型

茶酒發(fā)酵過程中，酵母菌利用酒液中的糖類來發(fā)酵產生酒精，酒精生成與酵母菌的生長屬于生長“偶聯型”，也就是說隨著酵母菌的生長而不斷發(fā)酵產生酒精，二者之間的變化應該是一致的。在茶酒發(fā)酵初期，酵母菌因需要適應生長環(huán)境而生長速度較慢，在該階段中酒精度的增加也是緩慢的；而隨著酵母菌適應生長環(huán)境以后，進入指數生長期時，該階段的酒精含量也隨之呈指數上升；當酵母菌的數量繁殖到一定程度時，體系中的基質糖分含量減少，菌體會呈現穩(wěn)定生長時，說明該體系酒精度也比較恒定，達到發(fā)酵末期。因此，選用Luedeking-Piret[22-23]模型來擬合乙醇生成動力學模型，即：

因 a≠0，b=0，模型可簡化為：

上式兩邊積分得：

式中：a 為生長偶聯參數；t 為發(fā)酵時間，h；P 為產物酒精度，%vol。

1.3.3 底物消耗動力學模型

糖類物質在茶酒發(fā)酵過程中，主要是作為碳源，用來提供酵母菌生長繁殖所需要的能量。隨著酵母菌的生長呈現“S”型，體系內的糖類被酵母菌不斷地消耗，殘?zhí)橇恳膊粩嘞陆?。本研究將DoseResp 模型應用到茶酒發(fā)酵動力學模型上，來對發(fā)酵過程中殘?zhí)橇窟M行擬合。方程式為：

上式兩邊積分得：

式中：S（0）為初始糖濃度，g/L；t 為發(fā)酵時間，h；M0為菌體細胞維持相關常數；X 為菌體量，g；P 為產物酒精度，%vol；Yx/s為最大細胞得率系數；Yp/s為產物得率系數。

2 結果與討論

2.1 茶酒發(fā)酵過程中總糖的變化

茶酒發(fā)酵過程中總糖的變化如圖1。

從圖1可以知道，在發(fā)酵初期，由于酵母菌大量生長繁殖的需要，對糖的利用率很高，導致降糖速度非?？臁ｋS著發(fā)酵的進行，降糖速度變慢，主要是由于酒精含量和酸度的不斷增加，均會在一定程度上影響釀酒酵母的代謝活動能力，從而降低了糖的消耗速度。直到總糖不再變化時，發(fā)酵也幾乎停止，到主發(fā)酵結束時總糖含量為7.5 g/L。

圖1 發(fā)酵過程中總糖的變化Fig.1 Changes of total sugar consumption during fermentation process

2.2 茶酒發(fā)酵過程中酒精度的變化

酒精是茶酒的主要成分，它的含量高低，對酒的風味和品質有重要影響。茶酒發(fā)酵過程中酒精度含量的變化見圖2所示。

圖2 發(fā)酵過程中酒精度的變化Fig.2 Changes of alcohol accuracy during fermentation process

根據圖2可以看出，發(fā)酵前7 d 時酒精含量增加速度很快，第7 天后酒精含量增加緩慢，可能是因為茶酒中的酒精、茶多酚、咖啡堿在一定程度上對酵母的代謝有抑制作用。酒精度的變化與酵母菌的生長曲線相對應，說明二者呈“偶聯”狀態(tài)。在發(fā)酵后期酒精度幾乎不再增加，表明酵母進入衰亡期，發(fā)酵基本停止，酒精度為8.5%vol。

2.3 茶酒發(fā)酵過程中總酸的變化

總酸是茶酒發(fā)酵過程中的一個重要理化指標，它直接影響茶酒的風味，口感和品質。發(fā)酵液酸度變化主要來自酵母在生長、繁殖、代謝活動中產酸，隨著酸度的增加也有利于增強茶酒的抑菌作用，避免雜菌污染。茶酒發(fā)酵過程中總酸含量的變化見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中總酸的變化Fig.3 Changes of total acid during fermentation process

由圖3可知，發(fā)酵前5 d 酸度升高，原因是在發(fā)酵前期酵母菌代謝產生有機酸，第5 天之后，酸度有浮動，原因是酒液中的有機酸可以被酵母利用[24]。

2.4 茶酒發(fā)酵過程中酵母量的變化

茶酒發(fā)酵過程中酵母菌數量的變化直接關系到茶酒的品質。茶酒發(fā)酵過程中酵母量含量的變化如圖4所示。

圖4 發(fā)酵過程中酵母量的變化Fig.4 Changes of the amount of yeast during the fermentation process

由圖4可知，在發(fā)酵前2 d 里酵母菌生長速度較為緩慢，隨后進入對數生長期后開始進行大量繁殖。第9 天后釀酒酵母細胞數量增加變緩，接近發(fā)酵結束時，酵母菌受到酒精和生長條件惡化的影響開始出現下降趨勢。

2.5 茶酒發(fā)酵過程中茶多酚的變化

茶多酚是茶酒中的重要功能成分之一，具有抗氧化、抗輻射、解毒等作用[25]。茶酒發(fā)酵過程中茶多酚含量的變化見圖5。

從圖5可以看出，隨著發(fā)酵過程的進行，茶酒里茶多酚的濃度在不斷下降，原因可能是酶促反應和氧化反應的影響[26]，茶多酚在光照、有氧的條件下會發(fā)生氧化聚合反應，形成茶色素類物質；尤其在發(fā)酵初期，茶酒中的氧氣含量較高，茶多酚的降低幅度較大[27-28]。隨著茶酒中總酸的增多，使得酶促反應和氧化作用減弱，因此在發(fā)酵后期茶酒中茶多酚的含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結束時茶多酚的濃度為2 902.35 mg/L。

圖5 發(fā)酵過程中茶多酚的變化Fig.5 Changes of tea polyphenols in fermentation process

2.6 茶酒發(fā)酵過程中氨基酸的變化

氨基酸也是茶酒中的重要功能成分之一，其具有鮮味，跟茶酒的香氣、品質和滋味有著非常重要的關系。茶酒發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化見圖6。

圖6 發(fā)酵過程中氨基酸的變化Fig.6 Changes of amino acids during fermentation process

從圖6可以看出，在發(fā)酵前期游離氨基酸的含量先是迅速上升，隨后又開始下降，在發(fā)酵中期游離氨基酸的含量逐漸下降，最后趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵末期茶酒中游離氨基酸的含量為0.002 49 mg/100 mL。

2.7 茶酒發(fā)酵動力學研究

茶酒發(fā)酵動力學模型主要是研究發(fā)酵過程中菌體生長、產物生成和底物消耗的關系，以及這幾個指標與發(fā)酵時間的聯系。本試驗采用MATLAB 對茶酒發(fā)酵過程主要理化指標的試驗數據進行非線性擬合，建立動力學方程，并采用DPS 數據處理系統進行差異顯著性分析，來探究茶酒發(fā)酵規(guī)律，為優(yōu)質茶酒的開發(fā)和研制提供理論基礎。

2.7.1 菌體生長動力學模型

采用Logistic 經典模型對茶酒發(fā)酵過程中酵母菌的數目進行擬合，得到圖7所示擬合曲線，方差分析結果如表1所示。

模型的預測值和實測值的平均擬合誤差為2.32%，模型的 F 值為 390.031，P 值≤0.01，呈現極顯著，表明擬合效果好，說明該模型能較好地描述茶酒發(fā)酵過程酵母菌數的動態(tài)增長過程。擬合求解得X0=0.086；μm=0.358，Xm=0.235；并帶入方程得到酵母生長動力學模型方程為：

圖7 茶酒發(fā)酵過程中酵母菌生長擬合曲線Fig.7 The growth fitting curve of yeast in the process of fermentation

表1 茶酒酵母菌體生長動力學模型方差分析表Table 1 Analysis of variance of fermentation kinetic model of yeast

2.7.2 酒精度生成動力學模型

茶酒發(fā)酵過程中酒精生成量實際值與擬合曲線如圖8所示，方差分析結果如表2所示。與圖7對比可知，酒精的生成與酵母菌的生長基本同步。模型的預測值和實測值的平均誤差為3.82%，模型的F 值為1 439.068，P 值≤0.01，呈現極顯著，表示擬合效果良好，說明該模型能夠較好地描述茶酒發(fā)酵過程酒精的動態(tài)增長過程。根據不同時間的酒精含量試驗數據（P），將公式（8）和 X0帶入公式（5），運用軟件進行擬合，經運算得到a=59.438。將運算得到的參數值帶入公式（5），得到茶酒發(fā)酵過程中產物生成動力學模型為：

圖8 茶酒發(fā)酵過程中酒精生成擬合曲線Fig.8 The fitting curve of alcohol content in the process of fermentation

表2 茶酒酒精生成動力學模型方差分析表Table 2 Analysis of variance of fermentation kinetic model of alcohol content

2.7.3 底物消耗動力學模型

底物消耗動力學方程擬合采用DoseResp 模型進行，得到的擬合曲線如圖9所示，方差分析結果如表3所示。

圖9 茶酒發(fā)酵過程中底物消耗擬合曲線Fig.9 The fitting curve of Substrate consumption in the process of fermentation

表3 茶酒底物消耗動力學模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of fermentation kinetic model of substrate consumption

模型的預測值和實測值的平均擬合誤差為5.53%，模型的F 值為3 182.341，P 值≤0.01，呈現極顯著，說明擬合效果較好，表明該模型能夠較好地反映茶酒發(fā)酵過程中底物消耗的動態(tài)變化。擬合求解得1/Yx/s=161.93，1/Yp/s=12.54，M0=11.498；將式（5）帶入式（7），求解參數一并帶入方程得到底物消耗動力學模型方程為：

3 結論

本試驗采用Logistic 方程、Luedeking-Piret 方程與DoseResp 方程，利用MATLAB 對茶酒發(fā)酵過程中的菌體數目、酒精生成和糖消耗量分別進行方程擬合，采用DPS 數據處理系統進行差異顯著性分析，擬合平均誤差分別為2.32%、3.82%、5.53%，模型的F 值分別為 390.031、1 439.068、3 182.341，P 值均≤0.01，說明擬合效果良好，表明所選的方程可以較好地反映茶酒的發(fā)酵過程的動態(tài)變化。同時，本次試驗在進行動力學研究的基礎之上，測定了多種指標的變化，如茶多酚和氨基酸等。發(fā)酵結束時，茶酒中總糖含量為7.5 g/L，酒精度為8.5 %vol，游離氨基酸的含量為0.002 49 mg/100 mL，茶多酚的濃度為2 902.35 mg/L。在茶酒發(fā)酵過程中，總糖和茶多酚的變化趨勢也與之前的文獻報道一致[29]，進一步驗證了茶酒發(fā)酵過程物質變化的規(guī)律。

綜上，茶酒發(fā)酵過程中主要理化指標的變化呈現一定規(guī)律，這也與文獻報道[24]有所符合，從而為優(yōu)質茶酒的研究和開發(fā)提供理論基礎。茶酒發(fā)酵過程的機理較為復雜，本次僅研究分析了幾種重要的理化指標，對茶酒的生產研發(fā)有一定的指導意義，但要想生產出質量上乘的茶酒則需要進行更深入的研究。