陽文武 黃小蘭 周 濃 周祥德*

1（重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶404000）2（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶404120）

山梨酸是化學(xué)合成的防腐劑，能夠抑制食品中微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而延長(zhǎng)食品的保存時(shí)間，保持食品原有的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是我國(guó)目前用量最大的食品防腐劑之一。但山梨酸具有一定的毒性，因此必須對(duì)它的使用量和殘留量加以控制。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014規(guī)定，脆皮腸中允許添加一定量的山梨酸，因此對(duì)脆皮腸中山梨酸建立快捷、準(zhǔn)確的測(cè)定方法很有必要。目前常用的方法有薄層法、氣相色譜法、液相色譜法。其中液相色譜法高效、快速、靈敏度高，適合大批量樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀；KH-2000DB超聲清洗機(jī)；Sartorius萬分之一電子分析天平（QUINTIX224-1CN）。

山梨酸對(duì)照品溶液，購買于北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)：25561YW，170412；甲醇、甲酸，均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 試劑溶液配制

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：稱取106 g三水亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1000 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：稱取220 g二水乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1000 mL。

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加入適量水溶解，用水定容至1000 mL，經(jīng)孔徑0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol/L甲酸+20 mmol/L乙酸銨）：稱取1.54 g乙酸銨，加入適量水溶解，再加入75.2 μL甲酸，用水定容至1000 mL，經(jīng)孔徑0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液（含量為1.0 mg/mL）1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，貯存于4℃冰箱中。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別準(zhǔn)確吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用水將其稀釋成山梨酸含量分別為 1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用現(xiàn)配。

1.4 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到 0.001 g） 試樣于50 mL具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲（功率300W，頻率40kHz）20min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8000 r/min離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)屑铀?0 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8000 r/min離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過孔徑0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。在此基礎(chǔ)上考察了另外4種前處理方式對(duì)山梨酸提取效率的影響。

1.5 儀器條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙酸銨溶液∶甲醇=95∶5，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相比例對(duì)分離效果的影響

在1.5儀器條件下，山梨酸的保留時(shí)間為9.6min，但樣品峰有前沿，如圖1所示。

圖1 色譜圖（乙酸銨溶液∶甲醇=95∶5）

為使樣品目標(biāo)峰分離良好，在1.5儀器條件基礎(chǔ)上將流動(dòng)相比例調(diào)整為乙酸銨溶液∶甲醇=97∶3，流速降為0.9 mL/min進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖2。由圖2可知，結(jié)果目標(biāo)峰出峰時(shí)間延遲至11.5 min，樣品峰有前沿。

圖2 色譜圖（乙酸銨溶液∶甲醇=97∶3）

水相比例已經(jīng)很大，不太可能通過延遲出峰時(shí)間來達(dá)到分離目標(biāo)峰的目的，于是加大有機(jī)相比例，調(diào)整為乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖3。由圖3可知，出峰時(shí)間提前至8.7 min，樣品峰有比較好的分離。

圖3 色譜圖（乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8）

2.2 前處理方式對(duì)山梨酸提取效率的影響

在1.5儀器條件下，將流動(dòng)相比例調(diào)整為乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8，考查5種前處理方式對(duì)山梨酸提取效率的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同前處理方式對(duì)山梨酸測(cè)定值的影響

由表1可以看出，經(jīng)過4次提取后，樣品中的山梨酸基本被提取出來。另外比較第4組和第5組數(shù)據(jù)，可見沉淀劑對(duì)樣品中的山梨酸有微弱的吸附作用。

2.3 不同流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響

為使測(cè)得的數(shù)據(jù)更加科學(xué)、準(zhǔn)確，采用流動(dòng)相甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol/L甲酸+20 mmol/L乙酸銨∶甲醇=92∶8進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果出峰時(shí)間延遲至16.8 min，色譜圖見圖4。在此儀器條件下，重新測(cè)定了上述5組樣品，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，5組樣品的山梨酸值均有下降，可以初步推斷：當(dāng)流動(dòng)相為乙酸銨∶甲醇=92∶8條件下，樣品峰還是有包裹，且與目標(biāo)峰完全重疊。

圖4 色譜圖（甲酸-乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8）

表2 不同前處理方式對(duì)山梨酸值的影響

3 結(jié)論

本次盲樣的真實(shí)值為0.140 g/kg，與表2中2組、3組的值非常接近，由此可見，在測(cè)定脆皮腸中山梨酸時(shí)，流動(dòng)相應(yīng)選用甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol/L甲酸+20 mmol/L乙酸銨）∶甲醇=92∶8，前處理方式應(yīng)為：每次于殘?jiān)屑由倭克崛?次。