王 坤 曲亮璠 王祥河 劉 然 許勤虎

1（天津量信檢驗(yàn)認(rèn)證技術(shù)有限公司，天津300462） 2（天津市工業(yè)微生物研究所有限公司，天津300462）

3（天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司，天津300462）

雞樅菌（Termitomyces albuminosus），又名雞肉絲菇、三壇菌，味道鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，具有寶貴的藥用價(jià)值，在我國主要分布在云南、貴州、四川三省以及臺灣的一些地區(qū)，是食用菌中的珍品之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，雞樅菌含有的多糖、多酚、皂苷、多肽等活性成分，有抗氧化、延緩衰老、降血脂、消炎鎮(zhèn)痛、提高機(jī)體免疫力等多種功效。大多數(shù)雞樅菌的生長發(fā)育與土白蟻的活動(dòng)密切相關(guān)，兩者之間存在嚴(yán)格的共生機(jī)制，研究人員目前尚未探明其中機(jī)理，因此雞樅菌的馴化極其困難。在自然條件下生長的雞樅菌數(shù)量較少，且價(jià)格十分高昂，國內(nèi)雖有對野生雞樅菌馴化栽培的研究，但至今還沒有獲得成熟的人工栽培技術(shù)，也未見有大規(guī)模生產(chǎn)該菌株的報(bào)道。采用液體發(fā)酵培養(yǎng)雞樅菌菌絲體方法簡便，發(fā)酵速度快，周期短，易于回收，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品等行業(yè)，滿足日益增長的市場需求，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：雞樅菌。

試劑：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、B2、B6、B12等均為分析純；豆粕為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER AE200分析天平，METTLER Seven Multi pH計(jì)；蘇州凈化SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺；日本三洋MLS-3750高壓滅菌鍋；鄭州長城SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；上海博迅GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 雞樅菌液體發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1.1 液體種子的制備

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂20.0g/L。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%，蛋白胨2.0%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，pH值自然。

液體種子的制備：將大小為1 cm2的斜面菌種接入裝液量為150/500 mL的搖瓶，溫度22℃，175 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d。

1.3.1.2 發(fā)酵單因素試驗(yàn)

選擇常見的蛋白胨、酵母膏、豆粕、尿素、硝酸銨作為氮源，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12為生長因子。各氮源添加量為2.0%，各碳源添加量為4.0%，各生長因子添加量為1.0 mg/L，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，接種量7.5%，裝液量150/500 mL，pH值自然，溫度22℃，175 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵4 d后，以雞樅菌的生物量為指標(biāo)，篩選出最佳液體培養(yǎng)基的碳、氮源組成。

分別選取不同葡萄糖添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）；不同豆粕添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）；不同維生素B1添加量（0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L），磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，接種量7.5%，裝液量150/500 mL，pH值自然，溫度22℃，175 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵4 d后，以雞樅菌發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體生物量為指標(biāo)，確定碳源、氮源、維生素B1的最適添加量。

1.3.1.3 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，以期獲得雞樅菌菌絲體最佳發(fā)酵條件和最大菌絲體產(chǎn)量。

1.3.2 菌絲體生物量測定方法

雞樅菌發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體的生物量通過細(xì)胞干重法測定，具體方法為：取發(fā)酵產(chǎn)物于布氏漏斗進(jìn)行抽濾，棄去濾液，用蒸餾水將得到的雞樅菌菌絲體洗凈，重復(fù)上述操作，將得到的菌絲體置于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重。生物量按下式計(jì)算：

式中：X——菌絲體生物量，g/L；

W——菌絲體干重，g；

V——取樣體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對雞樅菌發(fā)酵的影響

圖1 不同碳源對雞樅菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中不同碳源對雞樅菌發(fā)酵的影響如圖1所示。在菌絲體液體培養(yǎng)試驗(yàn)中，碳源是除水分以外菌體細(xì)胞生長需要量最大的營養(yǎng)物質(zhì)，為雞樅菌的生長、代謝和功效成分的累積提供能量，約占細(xì)胞干重的50%。雞樅菌菌絲體在葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源的液體培養(yǎng)基質(zhì)中均能生長，且不同來源的單糖、雙糖、多糖對雞樅菌生物量的累積有不同的影響。當(dāng)以葡萄糖為碳源進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，雞樅菌菌絲體生長旺盛，通過搖床振蕩培養(yǎng)的方式培養(yǎng)4 d后，菌絲體生物量達(dá)到24.55 g/L。當(dāng)雞樅菌以可溶性淀粉為可利用碳源進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，菌絲體生長速度最為緩慢，菌絲體生物量最小為20.31 g/L。這可能是由于葡萄糖為小分子糖類，更容易被微生物利用和轉(zhuǎn)化，糖類的分子量過大，不利于發(fā)酵的進(jìn)行，由試驗(yàn)結(jié)果可知，雞樅菌液體發(fā)酵的最佳碳源為葡萄糖。

2.1.2 不同氮源對雞樅菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中不同氮源對雞樅菌發(fā)酵的影響如圖2所示。氮源的基本作用是為微生物生長過程中蛋白質(zhì)以及核酸的合成提供原料，其成分及來源屬性將直接影響到微生物菌體的生長，進(jìn)而影響相關(guān)功效成分的合成速度及最終得率。雞樅菌菌株在蛋白胨、酵母膏、豆粕、尿素、硝酸銨這幾種常見的有機(jī)、無機(jī)氮源的液體培養(yǎng)基質(zhì)中均能增殖，且不同種類的氮源對雞樅菌生物量的累積有不同的影響。

圖2 不同氮源對雞樅菌發(fā)酵的影響

由圖2可知，菌株對豆粕、酵母膏等有機(jī)氮源的利用率高于無機(jī)氮源。當(dāng)以豆粕為氮源時(shí)，雞樅菌菌絲體搖床振蕩培養(yǎng)4 d后，菌絲體生物量為24.55 g/L，高于其他氮源發(fā)酵菌絲體的產(chǎn)量。這可能是由于豆粕富含多種營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸、未知生長因子等，有利于微生物發(fā)酵，可促進(jìn)雞樅菌增殖，提高其菌絲體得率。因此，雞樅菌液體發(fā)酵的最佳氮源為豆粕。

2.1.3 不同生長因子對雞樅菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中不同生長因子對雞樅菌發(fā)酵的影響如圖3所示。大多數(shù)維生素是微生物代謝過程中某些酶的輔酶，與微生物體內(nèi)的能量代謝，與碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸和脂肪的生化反應(yīng)息息相關(guān)。在液體搖瓶培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L不同種類的維生素，可不同程度地促進(jìn)菌株菌絲體的生長繁殖。

圖3 不同生長因子對雞樅菌發(fā)酵的影響

由圖3可知，維生素B1、B2、B6、B12作為生長因子添加到培養(yǎng)基中發(fā)酵4 d后，雞樅菌菌絲體生物量分別為 24.61 g/L、22.94 g/L、23.57 g/L、22.90 g/L，較對照組分別提高了9.86%、2.41%、5.22%、2.23%。維生素B1對雞樅菌液體發(fā)酵的影響最為明顯，因此將維生素B1作為雞樅菌液體培養(yǎng)的生長因子。

2.1.4 葡萄糖添加量對雞樅菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中葡萄糖含量對雞樅菌發(fā)酵的影響如圖4所示。碳源含量對微生物發(fā)酵有著重要的影響，添加量過少，無法滿足菌體生長需求，降低菌株生長速度；添加量過多，多余糖分無法被充分利用，增加發(fā)酵成本，降低經(jīng)濟(jì)效益。由圖4可知，隨著液體培養(yǎng)基中碳源所占比例的增加，雞樅菌液體發(fā)酵所得菌絲體生物量也逐漸增加，當(dāng)葡萄糖的添加量為3.0%時(shí)，菌株發(fā)酵得到的生物量為24.61 g/L，達(dá)到最大值；當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源添加量超過3.0%時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量不再有明顯變化。因此，選擇葡萄糖的添加量為3.0%。

2.1.5 豆粕添加量對雞樅菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中豆粕含量對雞樅菌發(fā)酵的影響如圖5所示。氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)的主要元素，氮源是微生物的主要營養(yǎng)物質(zhì)。

圖5 豆粕添加量對雞樅菌發(fā)酵的影響

由圖5可知，隨液體培養(yǎng)基中豆粕添加量的增加，菌株的菌絲體生物量呈迅速增加的趨勢，當(dāng)豆粕添加量為2.0%時(shí)，菌絲生物量為24.23 g/L，達(dá)到最大值；當(dāng)液體培養(yǎng)基質(zhì)中的豆粕含量持續(xù)增加至5.0%，菌絲體的生物量不再有明顯的變化，說明適量增加氮源可促進(jìn)雞樅菌的增殖，培養(yǎng)基中過量的營養(yǎng)物質(zhì)并不能被菌株利用和轉(zhuǎn)化。因此，選擇豆粕的添加量為2.0%。

2.1.6 維生素B1添加量對雞樅菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中維生素B1含量對雞樅菌發(fā)酵的影響如圖6所示。由圖6可知，未添加維生素B1的對照發(fā)酵組通過搖床振蕩培養(yǎng)發(fā)酵4 d后，其菌絲體生物量達(dá)到22.21 g/L；維生素B1添加量在0.5 mg/L～2.5 mg/L的范圍內(nèi)，雞樅菌生物量分別達(dá)到23.72 g/L、24.76 g/L、24.37 g/L、23.90 g/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以維生素B1為生長因子，添加量為1.0 mg/L時(shí)，對雞樅菌液體發(fā)酵的促進(jìn)作用最明顯，相比于對照組菌絲體生物量增加了11.48%。因此，選擇維生素B1添加量為1.0 mg/L。

圖6 維生素B1添加量對雞樅菌發(fā)酵的影響

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)因素與水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖添加量1.0%、2.0%、3.0%，豆粕添加量1.0%、2.0%、3.0%，維生素B1添加量0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L為影響因素和水平，以發(fā)酵產(chǎn)物中雞樅菌菌絲體生物量為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交因素與水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3，驗(yàn)證試驗(yàn)見表4。

表1 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表2和表3可知，葡萄糖、豆粕、維生素B1添加量3種因素對雞樅菌液體發(fā)酵菌絲體的生長均有顯著性影響；通過極差值和F值大小判斷3個(gè)因素對菌絲體生物量的影響主次順序?yàn)椋浩咸烟翘砑恿浚径蛊商砑恿浚揪S生素B1添加量。因素A葡萄糖以A3水平最適，因素B豆粕以B2水平最適，因素C維生素B1以C2水平最適，因此最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量4.0%，豆粕添加量2.0%，維生素B1添加量1.0 mg/L。

2.3 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)優(yōu)化出雞樅菌發(fā)酵菌絲體的最佳工藝（A3B2C2）并未在正交試驗(yàn)表中出現(xiàn)，所以需要按照相應(yīng)的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，在葡萄糖添加量4.0%，豆粕添加量2.0%，維生素B1添加量1.0 mg/L的條件下，雞樅菌液體發(fā)酵的菌絲體生物量達(dá)到27.43 g/L，高于正交試驗(yàn)點(diǎn)的所得數(shù)據(jù)，說明優(yōu)化試驗(yàn)真實(shí)有效。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗(yàn)得出了不同碳源、氮源以及生長因子對雞樅菌生物量的影響，篩選出雞樅菌液體發(fā)酵的最適宜碳源、氮源、生長因子分別為葡萄糖、豆粕和維生素B1。通過正交試驗(yàn)結(jié)果可知，不同因素對雞樅菌液體發(fā)酵菌絲體的影響大小順序依次為葡萄糖添加量＞豆粕添加量＞維生素B1添加量，說明碳源對于該菌種發(fā)酵的影響高于氮源和生長因子。通過正交試驗(yàn)得到雞樅菌液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：葡萄糖添加量4.0%，豆粕添加量2.0%，維生素B1添加量1.0 mg/L，此條件下菌絲體生物量達(dá)到27.43 g/L。