佟 蕊 齊 穎 扈曉鵬 符云鵬 方國臻 王 碩

（天津科技大學(xué) 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 天津300457）

蘇丹紅染料本應(yīng)用于化工染色， 然而有些不法商家將其添加到辣椒制品中來增加產(chǎn)品的外觀新鮮度，以此吸引消費(fèi)者[1-2]。蘇丹紅染料屬于偶氮類染料，具有遺傳毒性和致癌性，食用含蘇丹紅的辣椒制品會對人體產(chǎn)生危害。 目前檢測蘇丹紅染料常用的方法有高效液相色譜法（HPLC）[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS/SIM）[5]，雖然這些檢測方法靈敏度高，但非常耗時，不能實現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測。研究開發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的方法具有重要意義。 薄層色譜（TLC）能夠用于分離復(fù)雜成分，并且有操作簡單，分離速度快，成本相對低廉的優(yōu)點[6]。 TLC 分析方法靈敏度較低，而表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）方法具有靈敏度高，檢測快速的優(yōu)點，可以實現(xiàn)定性和半定量檢測[7]。

本文建立了TLC-SERS 聯(lián)用檢測辣椒油中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的方法，對薄層色譜分離條件和拉曼光譜檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，由于辣椒油油脂含量高，所以采用固相萃取（SPE）進(jìn)行前處理，去除油脂和雜質(zhì)，有效凈化樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑 蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)品，購于AccuStandard Inc.；抗壞血酸（VA），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），氯金酸（HAuCl4·3H2O），購于Sigma-Aldrich；其他試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

薄層色譜硅膠板GF254， 購于青島海洋化工分廠；氧化鋁薄層色譜板AGF254，購于上海盛亞化工廠；硅膠薄層色譜板SG，購于濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ專用萃取柱（Cleanert Sudan），購于天津博納艾杰爾科技有限公司。 4 種不同品牌的辣椒油購于天津超市。

1.1.2 儀器 顯微共聚焦拉曼光譜儀，Renishaw。拉曼光譜檢測條件激發(fā)波長為785 nm，激發(fā)功率為100 mW，曝光時間10 s，掃描區(qū)間為500～2 000 cm-1，5 次累積掃描。

在JEM-2010FEF 透射電鏡上200 kV 條件下觀察所制備的基底。

1.2 試驗方法

1.2.1 基底的制備

基底一：銀溶膠的制備

將150 mL 濃度為0.02%的硝酸銀溶液放入微波爐中加熱至沸騰， 之后逐步滴入4 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，立刻再加熱2 min，混合溶液劇烈沸騰后，取出冷卻[8]。

基底二：金納米粒子（GNPs）的制備

采用檸檬酸鈉還原的方法[9]并做了適當(dāng)調(diào)整。

量取濃度為25 mmol/L 的氯金酸2.039 mL，加入47.961 mL 的去離子水混勻煮沸后， 加入8 mL 1%的檸檬酸三鈉， 溶液變?yōu)樯罴t色后繼續(xù)煮沸5 min，遮光，降溫后置于4 ℃冰箱中保存。

基底三：金納米棒（GNRs）的制備

采用晶種生長法進(jìn)行GNRs 的合成， 具體方法主要參考前人的方案[10-12]，并做了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

種子液的制備： 將7.5 mL 0.1 mol/L 的CTAB、250 μL 的10 mmol/L 的氯金酸溶液混合， 充分?jǐn)噭?，加?00 μL 的0.01 mol/L 的硼氫化鈉溶液。

生長液的制備： 量取4.75 mL 0.1 mol/L 的CTAB、200 μL 10 mmol/L 的氯金酸溶液和30 μL的0.004 mol/L 硝酸銀溶液，混勻后振蕩7 min，再加入32 μL 0.1 mol/L 的抗壞血酸溶液， 振蕩40 s。

量取10 μL 放置2 h 的種子溶液， 加入到生長液中，振蕩30 s，然后遮光靜置24 h 后，避光置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品前處理 模擬陽性樣品的制備及前處理：配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品溶液（正己烷為溶劑），根據(jù)濃度需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專?添加到經(jīng)高效液相色譜檢測不含蘇丹紅的0.5 g 辣椒油中，使辣椒油中蘇丹紅的加標(biāo)濃度分別為0.100，1，5，10，25，50，100，200 mg/kg，充分混合后，靜置過夜。

將0.5 g 模擬陽性樣品和實際樣品分別加入3 mL 正己烷提取蘇丹紅。

將上述蘇丹紅正己烷提取液加到分別用三氯甲烷和正己烷各5 mL 活化后的SPE 柱中，3 mL 3%異丙醇-正己烷溶液淋洗SPE 柱后，加入3 mL三氯甲烷洗脫蘇丹紅。洗脫液用氮?dú)獯抵两?，? mL 正己烷復(fù)溶，待測。

1.2.3 檢測方法 將蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液、 辣椒油經(jīng)SPE 處理后的待測溶液各5 μL 滴在薄層色譜板上，以正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮=100 ∶8 ∶6（體積比）為最佳展開劑進(jìn)行TLC 分離；用顯微共聚焦拉曼光譜儀檢測滴加基底的斑點。 使用WiRE 3.4 進(jìn)行光譜收集和基本處理，Origin 8.5.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜板的選擇

為了考察薄層色譜板拉曼背景光譜是否會對測定目標(biāo)物產(chǎn)生干擾， 本試驗選取了3 種不同材料的薄層色譜板GF254，AGF254，SG 進(jìn)行研究。AGF254含有氧化鋁和熒光劑，GF254含有硅膠和熒光劑，SG 含有硅膠不含熒光劑。 分別測定3 種薄層色譜板普通拉曼光譜圖及滴加2.5 μL GNRs 后的拉曼光譜圖， 由圖1 可知硅膠板AGF254與硅膠板GF254普通拉曼圖譜區(qū)別不大，在～1 013 cm-1處都有很強(qiáng)的拉曼峰。 但是滴加增強(qiáng)基底GNRs 之后， 兩者拉曼圖譜有很大的差別：GNRs 對薄層色譜板GF254的拉曼峰有增強(qiáng)作用，但是對薄層色譜板AGF254有猝滅作用。 對于薄層色譜硅膠板SG，不論普通拉曼光譜還是表面增強(qiáng)拉曼光譜其拉曼背景峰對目標(biāo)物的檢測影響都不大。 所以由上可以看出本試驗可用薄層色譜板SG 和薄層色譜板AGF254，因為蘇丹紅染料本身就有熒光，不需要紫外照射也能看到斑點，而且薄層色譜板SG 比薄層色譜板AGF254價格便宜， 所以試驗最終選擇硅膠板SG。

本試驗采用王群、潘文慧等[13]在測定眼影中蘇丹紅的薄層色譜分離條件即正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮= 100 ∶8 ∶6 （體積比）進(jìn)行薄層色譜的分離。

2.2 不同基底對蘇丹紅拉曼光譜增強(qiáng)效果的考察

圖1 不同類型的薄層色譜板的普通拉曼光譜圖（a）和表面增強(qiáng)拉曼光譜圖（b）Fig.1 Normal （a）and SERS （b）spectra of three of TLC Plates

研究比較了銀溶膠、GNPs、GNRs 3 種不同的拉曼增強(qiáng)基底，在薄層色譜板SG 上滴加質(zhì)量濃度為200 mg/L 蘇丹紅Ⅰ， 再分別滴加2.5 μL 的3種基底，測得拉曼光譜，如圖2 所示。由圖2 可知，GNPs 和GNRs 的增強(qiáng)效果比銀溶膠增強(qiáng)效果好，以GNPs 作為增強(qiáng)基底， 能微弱的看到蘇丹紅Ⅰ的特征峰1 597，1 551，1 496，1 448，1 386，1 341，1 260，1 228，1 168，989 cm-1，而從GNRs 增強(qiáng)的蘇丹紅Ⅰ拉曼圖譜可以很明顯地看到特征峰， 由此可見GNRs 的增強(qiáng)效果最好。目前SERS 增強(qiáng)機(jī)制大體有兩種，一種是化學(xué)機(jī)制，分子與底物之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移[14-15]；另一種是電磁場理論，是由于局部表面等離子激發(fā)增強(qiáng)效果與表面等離子振動（LSPR）有關(guān)[16-18]。 由此分析并猜測可能有以下兩點原因：一是因為相對銀溶膠，蘇丹紅染料更容易與GNPs 和GNRs 相互作用， 從而使拉曼信號增強(qiáng)； 二是因為金納米晶體能夠?qū)⒆杂煽臻g光的子波長集中起來并連接在它的表面， 使得金納米晶體周圍有很強(qiáng)的電磁場增強(qiáng)作用[19-21]，進(jìn)而使拉曼信號增加，造成GNPs 和GNRs 比銀溶膠增強(qiáng)效果好； 此外，GNRs 相對GNPs 存在巨大的優(yōu)勢就是它獨(dú)具兩種LSPR：一種是縱向LSPR，是由電荷振動引起的；另一種是橫向LSPR，是由于橫向光的偏振導(dǎo)致的[22]。 本試驗GNRs 基底增強(qiáng)效果好，猜想可能是由于GNRs 的縱向和橫向LSPR 共同作用使得拉曼信號增大的強(qiáng)度比GNPs 只存在一種LSPR 增強(qiáng)效果所致。

圖2 2.5 μL 的不同基底滴加在200 mg/L 的蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液上的光譜圖Fig.2 SERS spectra of 200 mg/L SudanⅠstork solution with 2.5 μL silver colloids （a）， GNRs （b）and GNRs （c）respectively on SG plates

2.3 滴加GNRs 次數(shù)的考察

分別以一次，兩次，三次將2.5 μL GNRs 滴加在經(jīng)過薄層色譜分離的蘇丹紅Ⅰ斑點上 （濃度為100 mg/L）。由圖3 可見，滴加次數(shù)對拉曼光譜強(qiáng)度有顯著影響，總量保持不變，分兩次滴加比一次滴加拉曼光譜增強(qiáng)效果好， 但并不是滴加次數(shù)越多越好，兩次以后增強(qiáng)效果減弱。猜想可能有以下原因： 隨著滴加次數(shù)增多，GNRs 逐漸在目標(biāo)物上完全形成單層覆蓋，導(dǎo)致拉曼信號增強(qiáng)，但是滴加次數(shù)過多，超過了單層覆蓋，達(dá)到多層覆蓋反而會影響拉曼信號強(qiáng)度，使得拉曼信號強(qiáng)度降低；另一種原因可能由于增加滴加次數(shù)， 使金納米粒子之間相互作用聚集，適當(dāng)?shù)木奂瘯鰪?qiáng)拉曼信號，過度的聚集會使信號減弱[23]。 所以本試驗選擇滴加次數(shù)為兩次。

2.4 模擬陽性樣品的檢測與數(shù)據(jù)處理

對蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行TLC 分離，分兩次滴加2.5 μL GNRs 基底，拉曼光譜儀檢測，得到圖4。由圖4 可見，蘇丹紅染料明顯的分離并得到對應(yīng)的拉曼光譜。 其拉曼光譜分別與蘇丹紅Ⅰ～ Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜進(jìn)行對照， 可知4 個點從上到下依次為蘇丹紅Ⅱ、 蘇丹紅Ⅰ、 蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅Ⅲ。

圖3 2.5 μL 的金納米棒的不同滴加次數(shù)的蘇丹紅Ⅰ拉曼光譜圖Fig.3 The SERS spectra of 100 mg/L SudanⅠwith different adding times of 2.5 μL GNRs on SG plates

圖4 蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)混合液經(jīng)過薄層色譜分離并拉曼光譜檢測Fig.4 SudanⅠ～Ⅳstandard mixture solution after TLC and their spectra respectively

對含不同濃度蘇丹紅的辣椒油模擬陽性樣品進(jìn)行固相萃取除雜，TLC 分離，分兩次滴加2.5 μL GNRs 基底，用拉曼光譜儀檢測，過程如圖5，得到的拉曼光譜如圖6。 圖6 表明，在一定濃度范圍內(nèi)隨著蘇丹紅染料濃度的降低特征峰拉曼信號強(qiáng)度減弱。由圖6A 很明顯的看出隨著蘇丹紅Ⅰ濃度降低，其特征峰1 597，1 551，1 496，1 448，1 386，1 341，1 260，1 228，1 168，989 cm-1信號強(qiáng)度隨之減弱， 其中1 597 cm-1可能由苯環(huán)C-C 鍵剪切或者N=N 鍵伸縮引起的，1 496 cm-1可能由苯環(huán)平面的C-H 彎曲或N=N 拉伸或苯環(huán)的C-C 拉伸引起的[24]。 當(dāng)蘇丹紅Ⅰ濃度低至為1 mg/kg 時，仍然可以看到其特征峰的出現(xiàn)， 所以蘇丹紅Ⅰ的最低檢出限為1 mg/kg。 同樣由此可以看出蘇丹紅Ⅱ主要特征峰為1 610，1 496，1 381，1 342，1 240，1 225 cm-1，其最低檢出限為1 mg/kg。 蘇丹紅Ⅲ主要特征峰為1 597，1 500，1 465，1 443，1 419，1 389，1 337，1 233，1 138 cm-1；蘇丹紅Ⅳ在1 599，1 473，1 384，1 229，1 200，1 170，1 098 cm-1位置存在特征峰，最低檢出限都為0.100 mg/kg。

圖5 模擬陽性樣品檢測流程圖Fig.5 Schematic illustration of TLC-SERS for detection of Sudan dyes in hot chili oil

圖6 模擬陽性樣品添加不同量的蘇丹紅染料的拉曼圖譜Fig.6 SERS spectra of unequal amount of additives in positive sample

3 實際樣品的檢測

實際樣品按照1.2.2 節(jié)和1.2.3 節(jié)處理并檢測，沒有檢測出蘇丹紅。為了驗證本方法的可靠性與實際性，4 種樣品用高效液相色譜進(jìn)行檢測，同樣沒有檢測出蘇丹紅。

4 結(jié)論

本文建立了TLC-SERS 聯(lián)用檢測辣椒油中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的方法，該方法具有靈敏、快速的特點，為蘇丹紅的現(xiàn)場檢測提供了可靠方案。