吳高峰 黃占旺 王素貞 黃永平

（江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室 江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 南昌330045）

隨著抗生素的發(fā)明和使用， 人類對抗生素的濫用也越來越嚴重[1]?？股厥且环N由細菌、真菌、放線菌等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，能抵抗病原體等，它主要治療微小病原體引起的感染。 中國是抗生素生產(chǎn)和使用大國， 全國醫(yī)院抗菌藥物年使用率超過74%， 抗生素引起的細菌耐藥性年死亡數(shù)超過8 萬，婦產(chǎn)科濫用最嚴重[2]。 抗生素的濫用會導致機體不能識別益生菌和致病菌， 將正常菌群殺滅，致有害菌繁殖并引起菌群失調[3]。 尋找一種安全并且對機體有益的抗生素替代物非常必要。

納豆芽孢桿菌制劑是納豆菌通過液態(tài)發(fā)酵后添加保護劑凍干粉碎制成， 是一種良好的免疫促進劑，它能提高抗體水平和吞噬細胞的活性，提高細胞免疫和體液免疫[4-5]，并且能夠產(chǎn)生抗原物質，刺激建立免疫系統(tǒng)， 并提高非特異性免疫功能[6]。陳兵等[7]認為納豆芽孢桿菌提升了腸道許多厭氧菌的數(shù)量，部分需氧菌數(shù)量下降。 黃俊才等[8]提出納豆芽孢桿菌能夠顯著增加仔豬結腸內(nèi)容物中乳酸菌、雙歧桿菌的數(shù)量，在通過與甘露聚糖混合使用時顯著降低大腸桿菌數(shù)量。吳德華等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的納豆芽孢桿菌能夠顯著增加乳酸菌數(shù)量而降低大腸桿菌量， 無納豆芽孢桿菌時大腸桿菌數(shù)量顯著上升。Inooka 等[10]通過一系列的試驗研究發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌能夠增強綿羊紅細胞的抗體產(chǎn)生并顯著增加雞脾臟T、B 淋巴細胞的數(shù)量，增強雞的細胞免疫反應。 劉宇等[11]采用含有2×109CFU/g 納豆芽孢桿菌的混合的活菌制劑， 能顯著增加斷奶仔豬的血清溶菌酶含量。 李云鋒等[12]研究發(fā)現(xiàn)納豆菌制劑能夠刺激細胞因子IL-6，Toll樣受體-9，IL-1 等的分泌。 納豆芽孢桿菌制劑是一種健康無毒的抗生素的替代物。 耿春銀等[13]研究發(fā)現(xiàn)納豆菌制劑能夠代替抗生素添加到斷奶仔豬飼料。試驗證明，添加納豆芽孢桿菌有助于增加胃腸道的益生菌生長，而對需氧菌或腸桿菌、腸球菌等產(chǎn)生拮抗作用[14]，減少致病菌的定值[15]。 本試驗采用抗生素建立菌群失衡模型， 利用Miseq 法來研究納豆芽孢桿菌制劑對小鼠腸道菌群的調控作用并進行生物信息分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌制劑（BNPr），活菌數(shù)為4×1010cfu/g，實驗室自制。 KM 小鼠，雌性SPF 級，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。 鹽酸林可霉素 （批號：20130902）、氨芐青霉素（批號：104D038），購自Solarbio 公司；頭孢唑啉鈉，購自梯希愛TCI（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；FastDNA Soil Kit，購自MP Biomedicals，CA，USA。

1.2 主要儀器設備

TDL-5-A 低速離心機， 上海安亭科學儀器廠；凝膠電泳成像系統(tǒng)，Kodak，USA；PCR 反應儀，BioRad，USA； 高通量測序儀，Illumina China；生物分析儀，Agilent technologies，USA；NanoDropND-1000，Nano Drop Technologies，Willmington，DE，USA。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌制劑的制備 在100mL 的液體培養(yǎng)基中接入四環(huán)納豆芽孢桿菌純種， 培養(yǎng)16～18h 后制成納豆菌液體培養(yǎng)產(chǎn)物并測定活菌數(shù)。將其轉入滅好菌的鐵盤中，加入15%滅菌脫脂奶粉， 真空冷凍干燥制成納豆芽孢桿菌制劑，稱重，根據(jù)劉慧等[16]采用標準活菌計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.3.2 樣品采集[17]KM 雌性小鼠128 只，18～22 g，在SPF 小鼠生長環(huán)境下飼養(yǎng)。 小鼠適應性飼養(yǎng)一段時間后，隨機分為8 個組，每組16 只，分為兩批，組間體重差異不大于0.5 g。 把BNPr 配制成2.5，25，250 mg/mL 的溶液。 選取一組為空白對照組A，灌胃生理鹽水；其余組灌胃抗生素混合溶液（鹽酸林可霉素、頭孢唑林鈉、氨芐青霉素，濃度均為100 mg/mL）建模3 d 后，隨機選取4 組作為調節(jié)組，B 組灌胃生理鹽水，C-E 灌胃3 個劑量的BNPr；L 組作為模型組，灌胃抗生素溶液。 試驗期為30 d，灌胃量均為0.5 mL/只。 每天16：00 無菌收集小鼠糞便， 置于標記好的EP 管中，-80 ℃下保存。 取0，3，18，33，48 d 五個時間點（五個時間點之間的時間段分別稱為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期）的小鼠糞便樣品進行后續(xù)DNA 提取。

1.3.3 DNA 提取 每個樣品分別稱取約500mg 后利用FastDNA Soil Kit （MP Biomedicals， CA，USA）提取各樣品的總DNA，使用NanoDropRND-1000（NanoDrop Technologies， Willmington， DE，USA）對提取的總DNA 樣品進行濃度和純度檢測。

1.3.4 PCR 擴增及純化 參照文獻[18]方法進行操作。

1.3.5 建庫及Miseq 測序 參照文獻[19]方法進行操作。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 參照Pala-Ozkok 等[20]的方法，進行序列篩選，數(shù)據(jù)降噪分析，獲得樣品中微生物群落結構信息。

1.3.7 生物信息分析 進行序列分析， 得出物種分類；分析得出物種的α 多樣性；分析多樣本間的多樣性 （聚類分析，PCA 分析，Unifrac.weighted）；另外對單樣本的門水平及屬水平上的分類情況進行分析；對納豆芽孢桿菌、益生菌、致病菌菌數(shù)的變化進行分析，并進行劑量分析。

2 結果與分析

2.1 PCR 結果分析

經(jīng)過PCR，樣品濃度均大于20 mg/mL，A260/A280 均在1.80～2.00 之間，說明DNA 提取的質量高，可用于后續(xù)試驗。

2.2 序列信息和多樣性指數(shù)

由圖1 可見，OTU 系數(shù)AE、AL、BL 差異極顯著，AC、AD、BE、CL 差異顯著；Chao 系數(shù)AC、AE、AL 差異極顯著，AB、AD 差異顯著；Shannon 系數(shù)除了BD、DL、CE 差異不顯著，其余各組間均極顯著差異；ACE 系數(shù)AC、AE、AL 差異極顯著，AB、AD 差異顯著；Simpson 系數(shù)AC、AE、BC、BE、CD、CL、DE、EL 差異極顯著， 其余各組差異不顯著；Good coverage 系數(shù)AB、AC、AD、AE、AL 差異極顯著，BC、BE、BL 差異顯著。

圖1 BNPr 對腸道菌群的序列信息和多樣性指數(shù)影響Fig.1 Effect of BNPr to the sequence information and diversity indexes of the intestinal microflora

2.3 門水平上的分類情況

由圖2 可知， Ⅰ期主要由擬桿菌門、 放線菌門、變形菌門、脫鐵桿菌門、酸桿菌門、芽孢桿菌門以及一些未分類的門類組成， 其中主要以脫鐵桿菌門和擬桿菌門組成，兩者大約占到總數(shù)的80%～90%，擬桿菌門是腸道糞便中的主要微生物，脫鐵桿菌門是一類通過專性或兼性厭氧代謝獲得能量的細菌，可利用多種電子受體。變形菌門在細菌中屬于最大的一門。 Ⅱ期主要由厚壁菌門、 擬桿菌門、酸桿菌門、變形菌門，存在一些Ⅰ時期未出現(xiàn)的門類，如TM7（研究表明它能引起炎性黏膜病，在消化道慢性炎癥中起著一定的作用），還發(fā)現(xiàn)了少量的無壁細菌類（柔壁菌門），它無細胞壁，無肽聚糖成分，對四環(huán)素敏感。在模型組由于長期灌胃抗生素，變形菌門占到總門類的95%左右，而變形菌門中有大量的病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋菌等。說明長期服用抗生素會對人體腸道造成嚴重的傷害， 導致腸道菌群不均衡，引發(fā)許多疾病。 Ⅲ期是灌胃藥物的后期，此期主要有厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門以及放線菌門、變形菌門等構成，且厚壁菌門的比例較Ⅱ期增加，厚壁菌門細胞壁含肽聚糖最高，約50%～80%，都是化能自養(yǎng)型，可產(chǎn)生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境，它包括芽孢桿菌屬，腸球菌屬。 并且厚壁菌門與擬桿菌門的比例的大小與人體的肥胖有關[21]。該期的厚壁菌門和擬桿菌門的比例合適。另外，模型組的厚壁菌門繼續(xù)增加，而變形菌門不斷減少， 說明納豆芽孢桿菌的灌胃能夠有效地調節(jié)腸道菌群的平衡。Ⅳ期是停灌后的菌群，它主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門組成，而未檢測出酸桿菌門。 酸桿菌門是新近被分離出來的一門細菌，它們是嗜酸菌，在腸道中能夠存活。AB 兩組的厚壁菌門的含量基本達到建模前的水平，而BNPr組的腸道菌群也恢復很快，說明BNPr 在一定的時間內(nèi)， 停服一定劑量的抗生素后能夠恢復腸道菌群的數(shù)量水平及其比例。 模型組的擬桿菌門都顯著增加， 厚壁菌門和擬桿菌門的比例也進一步減小。 另外，對比小鼠整個試驗期的體重變化，我們發(fā)現(xiàn)這與厚壁菌門和擬桿菌門的比例變化呈正相關關系。

圖2 BNPr 對小鼠腸道菌群門水平分類情況影響Fig.2 Effects of the BNPr to the classification information at phylum level of the intestinal microflora in mice

2.4 屬水平上的分類情況

圖3 BNPr 對小鼠腸道菌群屬水平的分類情況影響Fig.3 Results of the BNPr to the classification information at genus level of the intestinal microflora in mice

由圖3 可見， Ⅰ期共檢測出157 個科411 個屬，主要由乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、別樣桿菌屬、生物分類地位未定的TM7 屬、理研桿菌屬、小螺菌屬、臭氣桿菌屬、雙歧桿菌屬以及腸桿狀菌屬等組成，分別占到總菌屬的65.52%，10.86%，4.98%，3.14%，2.69%，1.97%，1.09%，1.02%，0.88%，0.68%。Ⅱ期共檢測出142 個科326個屬，主要由乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、腸桿菌屬、副擬桿菌屬及18 號梭菌屬構成，它們分別占到總菌屬的32.89%，32.76%，18.20%，10.36%，0.81%。 乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬較Ⅰ期極顯著降低，而擬桿菌屬、 副擬桿菌屬、 腸桿菌屬的占比都極顯著增加，同時副薩特氏菌、克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬/志賀氏菌，糞桿菌屬等的比例都顯著升高，而乳球菌、別樣桿菌屬等顯著降低，說明抗生素的攝入使得腸道菌群結構發(fā)生變化，益生菌如乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬的數(shù)量減少而致病菌如埃希氏菌屬、志賀菌屬、糞桿菌屬等菌屬的比例升高。Ⅲ期為灌胃藥品后期，該期主要檢測出142 科323 屬，主要由乳酸桿菌、擬桿菌屬、腸桿菌屬、副擬桿菌屬、14號a 梭菌屬、18 號梭菌屬、 布勞特氏菌屬等構成，它們分別占總菌屬的45.24%，23.47%，11.95%，7.26%，5.00%，0.85%，0.72%。 該期與灌胃后期相比，乳酸桿菌屬的比例極顯著升高，而擬桿菌屬、腸桿菌屬、 副擬桿菌屬的比例顯著降低， 乳球菌屬、別樣桿菌屬、腸桿狀菌屬、雙歧桿菌屬等占比有所提高，而副薩特氏菌屬、克雷伯氏菌屬等比例有所下降， 并且在這個時期出現(xiàn)了灌胃后期未檢測到的中村氏菌屬、束縛桿菌屬、動膠菌屬、羅賓遜氏菌屬、摩根氏菌屬等，說明隨著BNPr 的灌胃天數(shù)的增加能夠更加有效地調節(jié)腸道菌群向正常菌群的方向進行。模型組主要由腸桿菌屬及14 號a 梭菌屬組成，而其它各組中這兩種菌屬檢測出的比例遠遠小于模型組。Ⅳ期為停止灌胃后的時期，該期共檢測出123 科281 屬，主要由乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、腸桿菌屬、糞桿菌屬、生物分類地位未定的丹毒絲菌屬、別樣桿菌屬、螺旋桿菌屬及18 號梭菌屬， 它們分別占總菌屬的47.32%，23.62%，10.77%，6.15%，1.36%，1.35%，1.15%，0.91%。 該期乳酸桿菌屬的比例繼續(xù)增加，擬桿菌屬、18 號梭菌屬基本保持不變， 別樣桿菌屬、副擬桿菌屬、螺旋桿菌屬、腸桿狀菌屬、糞桿菌屬均顯著增加，腸桿菌屬極顯著降低，生物分類地位未定的丹毒絲菌屬極顯著增加。統(tǒng)計分析可知，停灌期與建模前差異不顯著， 表明通過抗生素建模，灌胃納豆菌制劑30d 后，再停止灌胃讓其自由恢復，能夠達到建模前的腸道菌群水平，證明納豆芽孢桿菌存在明顯的腸道菌群調節(jié)作用。

2.5 聚類分析

2.5.1 基于OTU 的聚類分析（97% similarity）由圖4 可見， 在Ⅰ期， 模型組與其它各組之間的OTU 為1 時，它們的相似度小于0.32，當OTU 為2 時，相似水平小于0.52，OTU 為3 時，相似水平小于0.54，OTU 大于10 時， 樣本之間的相似性達到80%以上，且模型組的相似水平最高為0.79。在Ⅱ期，模型組與其它各組的相似性僅為0.07，較建模前極顯著下降。 各個組之間的相似性都有所提高，OTU 為1 時，相似性僅為0.07，OTU 為2 時相似性為0.62，OTU 大于9， 各組的相似性超過80%，模型組的相似性達到0.96，高于建模前的水平。 灌胃后期當OTU 為1 時，模型組與其他組間相似性為0.08，較灌胃前期有所增加，各組之間的相似性繼續(xù)提高， 而模型組之間的相似性有所下降，當OTU 為2 時，模型組與其余組之間的相似性小于0.66，當OTU 大于8 時，樣本間的相似性超過80%。在停灌期小鼠腸道功能逐漸恢復，能夠自發(fā)的調節(jié)腸道菌群的動態(tài)， 模型組與其余各組間的相似性繼續(xù)增加， 與建模前差異不顯著，當OTU 大于11 時，各組之間的相似性大于80%。

圖4 BNPr 對小鼠腸道菌群基于OUT 水平的聚類分析結果Fig.4 Results of the BNPr to the clustering analysis at OUT level of the intestinal microflora in mice

2.5.2 基于門水平的聚類分析 由圖5 可知，建模前各個組間相似性最低為0.72，最高為CD 組，達到0.985，說明各組之間門水平差異不大。 灌胃前期模型組與其余各組的差異明顯增大， 模型組的相似性為0.99， 而模型組與其余各組之間的相似性只有0.12， 較建模前極顯著降低，E 組與ABCD 組的差異較大。 灌胃后期組間的差異性極顯著減小， 相似性達到0.43， 較灌胃前期的0.12極顯著升高，當OTU 大于2 時，相似性大于80%，OTU 大于4 時，相似性大于90%，說明納豆菌制劑能夠有效改善腸道菌群， 調節(jié)菌群向腸道正常狀態(tài)的水平發(fā)展。 A 與CE 的相似度在0.79，而灌胃前期A 與E 的相似度為0.87，AC 的相似性為0.875，AD 的相似性為0.91。 停灌期模型組與其余各組的相似性繼續(xù)增加， 達到0.5， 模型組與DE組的相似性顯著提高至0.7。

圖5 BNPr 對小鼠腸道菌群基于門水平的聚類分析結果Fig.5 Results of the BNPr to the clustering analysis at phylum level of the intestinal microflora in mice

2.5.3 基于屬水平的聚類分析 從圖6 可以看出， 建模前各組之間的屬水平相似性在0.65 以上，AD 組間的差異最小， 相似度最高為0.94，BCDE 組與A、L 組屬水平無顯著差異。 灌胃前期由于抗生素建模，使得腸道微生物大量死亡，種屬發(fā)生變化， 模型組與其他各組間的差異極顯著增大， 其相似性僅為0.06， 而與空白對照組相比，BCDE 4 組對應的種屬相似性都增加，且C＞D＞E，說明納豆菌制劑恢復腸道菌屬， 且隨著納豆菌制劑的劑量增加而降低，AC、AD 組的種屬相似性與AB 組相似性基本持平，說明低中劑量的納豆菌制劑更有利于腸道菌群的恢復。 灌胃后期除了模型組外，各組間的種屬相似性繼續(xù)提高，與空白對照組相比，AB、AC 的相似度有所下降，而AD、AE 的相似度基本不變，且AD 的相似度最高為0.82，說明后期中劑量納豆菌制劑對于腸道菌群的調節(jié)作用更明顯。在停灌期，模型組與其它各組的相似度極顯著提高達到0.33，而與空白對照組相比，AC、AD、AE 的種屬相似度較灌胃后期顯著降低，AB的相似度達到0.92，AC 的相似度與建模前相同，AD、AE 相似度最低僅為0.33，其主要原因是停灌藥品后腸道菌群自由恢復，與空白對照組相比，中高劑量納豆菌制劑調節(jié)組的乳酸桿菌屬極顯著降低而擬桿菌屬極顯著升高， 而低劑量組與空白對照組在屬水平上基本保持一致。

圖6 BNPr 對小鼠腸道菌群基于屬水平的聚類分析結果Fig.6 Results of the BNPr to the clusting analysis at genus level of the intestinal microflora in mice

2.6 Unifrac. Weighted 分析

Unifrac.weighted 是綜合考慮了不同分類單元的物種進化速率和所占比重的一種計算不同樣本之間微生物群落結構相似度的指標，Score 代表樣品之間的差異程度，數(shù)值區(qū)間為0～1，值越大，代表兩樣品之間差異性越大， 相似度越低。 Sig 為significance 縮寫，代表Score 的置信度，一般認為Sig<0.001 表示Score 值是可信的。

結果表明， 在不同的時間點上組間無顯著差異。在不同的組之間，由于對試驗組進行了不同劑量的納豆菌制劑的灌胃， 使得腸道中微生物發(fā)生改變，從而導致了樣本間的差異及與試驗前不同。AL、BL、CL、DL、EL 與其它各組，AE 與AA、AB、BB、BC、CC、CD、EE、LL，BE、AD 與CC、EE、LL，AC、BD與CC、LL，LL 與AA、AB、BB、BC、CC、CD、CE、DD、DE、EE，差異極顯著；AE 與AC、BD、CE、DD、DE，EE 與AC、BD，DD 與CC、EE，CC 與CE、DE差異顯著。

2.7 納豆菌、益生菌、致病菌的變化情況

圖7 結果表明： 建模前益生菌的比例為45.7%，致病菌的比例為0.89%，益生菌和致病菌的比值（簡稱益致比）為51.35；建模后灌胃BNPr，益生菌的比例顯著降低至29.23%，致病菌的比例極顯著增加至16.67%， 益致比極顯著降低至1.75； 灌胃后期益生菌的比例有所增加， 達到37.75%，而致病菌的比例下降至10.6%，益致比增加至3.56；停止灌胃后，腸道菌群自由恢復，由于沒有抗生素的介導，BNPr 對腸道菌群的調控作用繼續(xù)增加，益生菌的比例繼續(xù)增加，達到39.3%，而致病菌的比例極顯著降低至7%，益致比極顯著增加至5.61。在建模前，益生菌和益致比的水平最高，而建模后益生菌極顯著減少，灌胃后期恢復至正常水平的82.6%，停灌后15 d 恢復至86%；而致

病菌的變化正好相反，建模前最低，而建模后致病菌增加， 到灌胃初期時致病菌的值是建模前的18.73 倍，建模后期由于納豆菌的調節(jié)作用，致病菌極顯著減少，直至恢復正常水平。 綜上結果，納豆菌能夠有效調節(jié)腸道菌群失衡水平， 增加益生菌而減少致病菌在腸道的吸附定植。

表1 Unifrac. Weighted 分析結果表Table 1 Results of the unifrac. weighted analysis

表2 納豆菌、益生菌及致病菌變化情況表Table 2 Results of the variation of the Bacillis natto， probiotics and pathogenic bacteria

圖7 納豆菌、益生菌、致病菌和三者間的比例的變化情況圖Fig.7 Results of the variation of the Bacillis natto， probiotics and pathogenic bacterial and their portion variation

2.8 劑量分析

通過以上結果可見， 抗生素溶液能夠殺滅腸道中大部分的細菌，導致腸道菌群失調，而BNPr的灌胃能夠有效地改善這一狀況， 且不同劑量的BNPr 的作用效果不盡相同。 在建模后，灌胃初期各項指標與空白對照組和模型組相比中低劑量BNPr 作用效果更明顯，在灌胃后期中劑量的恢復作用更加明顯，而在停灌期3 個劑量BNPr 的調節(jié)水平趨于一致。 中劑量的多樣性指數(shù)高于另外兩個劑量組，因此中劑量BNPr 對于抗生素介導小鼠的腸道菌群調節(jié)作用最佳。

3 討論

益生菌是一種對宿主有益的活性微生物[22]，定植于人體腸道[23]、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用[24]。腸道中含有百萬計的細菌， 但是不是所有的細菌都是有益的， 在本論文研究納豆芽孢桿菌、 益生菌、致病菌和總菌群的數(shù)量變化情況。納豆菌是革蘭氏陽性菌，它能產(chǎn)生大量芽孢，耐熱性強，耐酸性強，因此能夠順利到達腸道并且發(fā)揮作用[25]。 納豆菌能夠抵抗抗生素的影響， 通過增殖吸附定植[6]，增強對腸道菌群的調節(jié)。人體、動物體內(nèi)有益的細菌或真菌主要有：酪酸桿菌、乳酸菌，雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、放線菌、酵母菌等[26]。 本試驗檢測到的益生菌主要有乳酸菌、雙歧桿菌、放線菌、嗜酸乳桿菌等。致病菌是能夠引起疾病的微生物，主要為腸桿菌科的一類致病菌，主要包括大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌及志賀氏菌等。致病菌在腸道中能夠大量繁殖，釋放毒素，侵襲腸道黏膜上皮細胞，引起細胞死亡造成潰爛[27]。 本試驗中致病菌在建模前數(shù)量很大，但是經(jīng)過建模期，致病菌的數(shù)量減少，而在灌胃期致病菌的數(shù)量顯著減少， 說明納豆菌能夠抑制致病菌的生長繁殖，減少致病菌的定植。

4 結論

DNA 提取質量高， 可用于后續(xù)試驗；OTU 系數(shù)隨著劑量的增加而降低，Chao’s 系數(shù)、Shannon系數(shù)、ACE 系數(shù)較空白對照組顯著降低，中劑量調節(jié)組最高。 Simpson 系數(shù)在低劑量最高，達到0.2633， 且低高劑量的值都極顯著高于空白對照組，Good coverage 系數(shù)空白對照組都極顯著低于其他各組，且3 個劑量組差異不顯著，中劑量組最高達到0.9868； 從門水平上的分類情況可見建模前主要以擬桿菌門、放線菌門、變形菌門為主，灌胃初期厚壁菌門大量增加，擬桿菌門降低，而灌胃后期，厚壁菌門繼續(xù)增加，停灌后直至試驗結束，AB 兩組厚壁菌門的含量基本達到建模前水平，厚壁菌門與擬桿菌門的比例進一步減小。 基于OTU的聚類分析情況如下：OTU 為1 時， 相似度為0.32，建模后到灌胃初期相似度僅為0.07， 停灌后OTU的相似度達到0.2。當樣本間相似度達到80%以上時，OTU 在建模前為10，灌胃初期為9，灌胃后期為8，而停灌期為11。 基于門水平上的聚類分析：建模前各組間的門水平相似度達到0.72， 而建模后直至灌胃初期各組件的而相似度僅為0.12，灌胃后期組間相似度增加至0.43， 停灌后相似度增加至0.5。 基于屬水平上的聚類分析：建模前屬水平相似度在0.65 以上，灌胃初期模型組與其他組的相似度僅為0.06， 在灌胃后期， 種屬相似度提高，在停灌期相似度達到0.33。 Unifrac. weighted在建模期、灌胃后期與灌胃初期、停灌期差異極顯著。 在建模前，益生菌和益致比的水平最高，而建模后益生菌極顯著減少， 灌胃后期恢復至正常水平的82.6%，停灌后15d 恢復至86%，而致病菌的變化正好相反， 建模前最低， 而建模后致病菌增加， 到灌胃初期時致病菌的值是建模前的18.73倍，建模后期由于納豆菌的調節(jié)作用，致病菌極顯著減少，直至恢復正常水平。 綜上結果，納豆菌能夠有效調節(jié)腸道菌群失衡水平， 增加益生菌而減少致病菌在腸道的吸附定植。 總之，中劑量BNPr對于抗生素介導小鼠的腸道菌群調節(jié)作用最佳。