鄭云鵬，趙紅杰，郭靖宇，呂肖楠

（飛鶴（龍江）乳品有限公司，黑龍江龍江161100）

0 引 言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種具有免疫功能的鐵結(jié)合性糖蛋白，相對分子質(zhì)量約為80 ku，具有抗菌性，抗病毒性，抗癌作用[1]。LF初乳中含量最高，另外在外分泌液（乳汁、唾液、淚液、鼻分泌物）、血漿、羊水、子宮分泌物和尿液中也含有LF[2]。

《乳鐵蛋白人群健康效應專家共識》指出攝入一定量從牛乳中分離提取的乳鐵蛋白，有助于改善嬰幼兒營養(yǎng)狀況，能夠降低嬰幼兒腹瀉、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、呼吸道疾病、新生兒敗血癥等疾病的發(fā)病風險[3]。目前，乳鐵蛋白已作為食品添加劑被廣泛應用于嬰幼兒配方奶粉及各種功能性食品中。乳鐵蛋白的檢測方法有有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫擴散法、放射免疫法和高效液相色譜法[4-5]。高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)是常用的檢測方法，但其前處理繁瑣，且無法除去生乳中其他雜質(zhì)對于乳鐵蛋白測定的干擾，免疫擴散法操作簡單，能夠快速檢測嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量[6]。通過優(yōu)化ELISA試劑盒樣本前處理方法，并檢測不同采樣點的樣本值，以期驗證試劑盒的驗證該試劑盒的準確性和穩(wěn)定性，及檢驗奶粉樣本中乳鐵蛋白的均勻性，為乳鐵蛋白含量檢測的的相關(guān)人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（Vitest，北京納百生物科技有限公司）；MK3酶標儀（Thermo）；分析天平（Sartorius）；移液器(RAININ 200、1000μL)；本公司批次不同奶粉樣本。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒檢測原理

試劑盒基于酶聯(lián)免疫原理，采用間接競爭的方法，樣本吸光度值與其所含乳鐵蛋白的含量成負相關(guān)，可定量檢測奶粉樣本中的乳鐵蛋白含量。

1.2.2 ELISA試劑盒操作步驟

（1）將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，恢復至室溫，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；

（2）樣品前處理：稱取0.1±0.005 g奶粉樣本至2 mL EP離心管中，加入1 mL 1×樣本稀釋液溶解，用渦旋儀渦旋至完全溶解，樣本最終稀釋2000倍，待檢；

（3）板孔及樣本編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，記錄標準孔和樣本孔所在的位置；

（4）加標準品/樣本和抗體工作液：加入標準品/樣本50 L到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50 L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30 min；

（5）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250 L/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，潑掉板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干；

（6）加酶標二抗：加入酶標二抗100 L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30 min，取出重復洗板步驟5；

（7）顯色：加入TMB底物液100 L/孔，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應15 min；

（8）測定：加入終止液50 L/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處測定每孔OD值，使用軟件（4參數(shù)法）繪制標準曲線，并計算樣品中乳鐵蛋白的含量。

1.2.3 試劑盒方法的準確性驗證

選取乳鐵蛋白陰性樣本進行添加回收實驗，添加濃度分別為30，80，100，和140 mg/100g。

1.2.4 試劑盒方法的可行性性驗證

選取含有乳鐵蛋白的8種奶粉樣本進行檢測。

1.2.5 樣品前處理方法優(yōu)化

取4 g樣本至50 mL離心管，加入40 mL去離子水稀釋至10倍，再用去離子水稀釋至100倍被，最后用1×樣本稀釋液稀釋至和2000倍，待測。

1.2.6 不同采樣點對檢測結(jié)果的影響

選擇4種奶粉樣本，每種樣本選擇3種不同的采樣點，采用優(yōu)化后前處理方案，進行檢測。

1.2.7 改良工藝后檢測奶粉樣本中乳鐵蛋白的均勻度

使用改良后的工藝，混合乳鐵蛋白。選擇4種樣本，每種樣本選擇3種不同的采樣點，采用優(yōu)化后前處理方案，進行檢測

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒方法的準確性驗證

配置一定濃度的乳鐵蛋白工作溶液添加至乳鐵蛋白陰性樣本中，使其終濃度為30、80、100、和140 mg/100 g。檢測結(jié)果顯示：標準曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見表1；加標樣品檢測值分別為34.4、74、115.6和132.6 mg/100 g，計算加標回收率分別為87.21%、108.11%、115.6%和105.58%，見表2加標回收率在87.21%-115.6%之間。此結(jié)果表明添加不同濃度的乳鐵蛋白，均有較好的回收率，試劑盒準確性符合要求。

表1 標準曲線結(jié)果

表2 加標回收結(jié)果

2.2 試劑盒可行性性驗證

8種不同的奶粉樣檢測結(jié)果顯示：標準曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見表3；樣品檢測值除奶粉樣1和奶粉樣3外，見表4，其余均符合樣品理論值（樣品理論值范圍為：40-86 mg/100 g）。后又對奶粉樣1和奶粉樣3進行復檢，結(jié)果顯示：標準曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見表5；奶粉樣1和奶粉樣3分別稱取的平行樣檢測值分別為42、45.6、59.8和46.2 mg/100 g，見表6，符合樣品理論值。分析這種異常值的出現(xiàn)可能是由于奶粉前處理方法不當，或者奶粉中的乳鐵蛋白混合不均勻，造成結(jié)果與理論值有較大偏差。

表3 標準曲線結(jié)果

2.3 樣品前處理優(yōu)化后檢測結(jié)果

使用優(yōu)化后的前處理方案連續(xù)2天對16種樣本進行檢測，結(jié)果顯示：標準曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見表7和表9；樣品檢測值全部符合品理論值，見表8和表10，未出現(xiàn)異常值現(xiàn)象。優(yōu)化后的前處理方案，連續(xù)跟蹤2天，18種奶粉樣，均為出現(xiàn)異常值，說明此優(yōu)化方案可行。

表4 奶粉樣本檢測結(jié)果

表5 標準曲線結(jié)果

表6 奶粉樣本檢測結(jié)果

表7 標準曲線結(jié)果

表8 奶粉樣本檢測結(jié)果

2.4 不同采樣點對檢測結(jié)果的影響

對奶粉樣本27、28、29、和30分別采取3種不同的采樣點采取樣本，使用優(yōu)化后前處理方案處理樣本，檢測結(jié)果如下：標準曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見表11；奶粉27和29檢測結(jié)果符合品理論值，而奶粉樣本28和30不同采樣點檢測結(jié)果偏差較大，見表12，其中奶粉樣本28-1和30-3與樣品理論值偏差較大，相對偏差達173%和171%。分析可能由于乳鐵蛋白是干法混合，會造成混合不均勻，所以造成不同采樣點，出現(xiàn)異常值。

表9 標準曲線結(jié)果

表10 樣本檢測結(jié)果

表11 標準曲線結(jié)果

表12 奶粉樣本檢測結(jié)果

2.5 改良工藝后檢測奶粉樣本中乳鐵蛋白的均勻度

由于干混法會造成乳鐵蛋白在奶粉樣本中混合不均勻，所以在干混法基礎上進行工藝改良。后又對對奶粉樣本31、32、33、和34分別采取3種不同的采樣點采取樣本，使用優(yōu)化后前處理方案處理樣本，檢測結(jié)果如下：標準曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見表12；4種奶粉樣本檢測結(jié)果均符合品理論值，見表13。

表12 標準曲線結(jié)果

表13 奶粉樣本檢測結(jié)果

3 討 論

乳鐵蛋白是奶粉中最重要的營養(yǎng)素之一[7]，選擇一種快速簡便準確的檢測方法對乳品廠十分重要。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)是測定乳鐵蛋白含量最常用的方法之一，張英華等[8]首次在國內(nèi)發(fā)表，應用酶聯(lián)免疫法測定牛初乳中乳鐵蛋白的含量；劉青等[9]使用ELISA法對市售的多個品牌的進口嬰幼兒配方奶粉中的乳鐵蛋白蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)此法有較好的適用性。本文中，選擇ELISA法檢測奶粉樣本，發(fā)現(xiàn)采用未優(yōu)化的前處理方案，檢測結(jié)果會出現(xiàn)異常值，分析可能是由于前處理方法不當，造成稀釋后的乳鐵蛋白在樣本中分布不均勻，或者是由于干法混合乳鐵蛋白造成乳鐵蛋白在樣本中不均勻；通過優(yōu)化前處理方法，連續(xù)跟蹤兩天實驗，檢測18個樣本，均未出現(xiàn)異常值，這說明優(yōu)化后的前處理方法對ELISA試劑盒有較好的適用性；3點采樣法檢測結(jié)果出現(xiàn)異常值，這就更加說明了使用干法混合會造成不同點的乳鐵蛋白含量可能不同，董昊昱等[10]報道干法混合會對微量營養(yǎng)素混合的均勻性有一定的影響。對工藝進行改良后，分3點進行采樣檢測，檢測結(jié)果均符合理論添加值，說明改良后的工藝，乳鐵蛋白混合均勻，符合產(chǎn)品設計標準。

4 結(jié)論

本研究使用ELISA快速檢測試劑盒檢測奶粉樣本中的乳鐵蛋白含量，線性關(guān)系良好，試劑盒加標回收率為87.21%-115.6%之間，符合檢測要求；通過優(yōu)化前處理方案，保證了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性；在干混法基礎上，通過工藝改良，乳鐵蛋白能在奶粉樣本中均勻存在。