趙 寧，魏春燕，王晨豫，孫延鳴

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832003)

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(Pulmonary surfactant-associated protein A，SP-A)是一種親水性的糖蛋白，其隸屬于C-型凝素家族成員，是肺部的一種天然免疫防御分子，在肺中起著十分重要的局部防御和天然免疫作用[1]。SP-A在肺炎支原體聚居的支氣管肺泡中特異表達(dá)，并且可與細(xì)菌、真菌、病毒結(jié)合并相互作用，已成為肺部先天免疫系統(tǒng)的一個(gè)特異組成部分，在呼吸系統(tǒng)中是抵抗病原菌的第一道防線[2]。SP-A是一種廣譜調(diào)理素，它具有膜透過性和殺菌特性，并且可以改變吞噬細(xì)胞的功能及活性，改善其對病原體的攝取、殺滅[3]。SP-A可以聚集大量病原微生物，其中包含細(xì)菌、真菌、酵母、病毒及螨浸出液。一方面，SP-A凝集的微生物更易于被巨噬細(xì)胞吞噬；另一方面，SP-A直接影響微生物的生長及成活[4]。目前人們對SP-A的研究大部分集中在小鼠和人，在綿羊有關(guān)該蛋白功能的研究鮮有報(bào)道。

巴什拜羊是一種新疆的地方性優(yōu)良品種，具有抗病力強(qiáng)的特點(diǎn)。盤羊體格健碩，是國家二級保護(hù)野生動物，通過與巴什拜羊雜交，其后代盤羊雜交羊生長快速，具有野生盤羊體型龐大的優(yōu)點(diǎn)，但抗病力低下。本實(shí)驗(yàn)室前期通過巴什拜羊與盤羊雜交羊人工感染綿羊肺支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)巴什拜羊?qū)O感染的抗性明顯高于盤羊雜交羊[5]。為證實(shí)該結(jié)果是否與SP-A有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室前期已利用RACE技術(shù)對巴什拜羊和盤羊雜交羊的SP-A基因進(jìn)行了克隆和真核表達(dá)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)及鎳柱層析法獲得純化的重組SP-A蛋白(rSP-A)[6]。本研究將巴什拜羊和盤羊雜交羊的rSP-A添加于MO培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法以及熒光定量PCR法，檢測巴什拜羊和盤羊雜交羊的rSP-A蛋白是否對體外培養(yǎng)的MO增殖產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 MO由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室剡根強(qiáng)教授惠贈，與Y-98標(biāo)準(zhǔn)株同源性為98%；E.coliDH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒小量提取試劑盒、GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司；pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTM購自TaKaRa公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 培養(yǎng)基制備 MO培養(yǎng)液：采用0.22 μm濾器過濾，添加15%胎牛血清，補(bǔ)充1‰氨芐青霉素，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

PPLO肉湯瓊脂板：PPLO肉湯粉2.1 g，葡萄糖0.5 g，低熔點(diǎn)瓊脂粉0.7 g，溶于100 mL蒸餾水中，調(diào)整pH值為7.4，高壓滅菌后待冷卻至60℃時(shí)補(bǔ)充20 mL預(yù)熱至40℃左右的胎牛血清及1‰氨芐青霉素，傾倒至直徑60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，凝固后倒置于4℃保存，本操作均在無菌環(huán)境中進(jìn)行。

1.3 平板菌落計(jì)數(shù)測定rSP-A對MO生長的影響MO培養(yǎng)液中接入20%體積的菌液，并于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)液顏色由紅變黃，調(diào)整菌液濃度為105ccu/mL[7]。實(shí)驗(yàn)分為4組，A、B、C組各加入兩種羊的 rSP-A至終濃度為10 μg/mL、20 μg/mL 和 40 μg/mL，并補(bǔ)充 5 mmol/L CaCl2，對照組(D組)加入20 μL酵母提取液，與MO菌液共同培養(yǎng)2 h后均勻涂布在PPLO肉湯瓊脂板上，37℃、5%CO2培養(yǎng)7 d，每組平板取9個(gè)視野，并在體式顯微鏡(10×目鏡，2×物鏡)下觀察菌落形態(tài)，對單個(gè)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。各組重復(fù)3次，取平均值。

1.4 熒光定量PCR檢測rSP-A對MO 16S rRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 采用張曉麗[7]建立的熒光定量PCR方法檢測在0、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h時(shí)各組MO 16S rRNA的基因拷貝數(shù)，比較各組檢測結(jié)果，分析rSP-A對MO 16S rRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft excel 2007和DPS7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用新復(fù)極差法(Ducan)分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 MO在PPLO肉湯瓊脂平板上培養(yǎng)一周后，肉眼可見平板上生長的支原體菌落呈現(xiàn)針尖狀，將瓊脂平板置于體視顯微鏡下，可觀察到支原體菌落為圓形、突起的露滴狀。培養(yǎng)基的瓊脂濃度會影響MO在顯微鏡下的形態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)基的瓊脂含量大于0.7%時(shí)，在體視顯微鏡下呈現(xiàn)露滴狀，與冷青文[8]報(bào)道一致，當(dāng)瓊脂濃度小于0.7%時(shí)，則呈現(xiàn)油煎蛋狀。A、B、C 3組分別加入不同濃度的兩種羊的rSP-A與MO菌液共培養(yǎng)2 h后涂布于PPLO肉湯瓊脂板上，對每組單個(gè)菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示(圖1)，加入巴什拜羊rSP-A的A、B、C組菌落數(shù)分別比對照組減少8.35%(p＞0.05)、23.04%(p＜0.05)、40.03%(p＜0.01)。加入盤羊雜交羊 rsP-A的A、B、C組與對照組相比菌落數(shù)分別減少6.73%(p＞0.05)、21.74%(p＜0.05)、37.11%(p＜0.01)。Piboonpocanun等研究顯示人和大鼠rSP-A能夠顯著抑制肺炎支原體的生長，同時(shí)SP-A與肺炎支原體結(jié)合依賴于鈣離子的存在。進(jìn)一步對其抑菌機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)SP-A與肺炎支原體之間的高度親和力依賴于膜中存在的飽和磷脂酰甘油，SP-A可以通過與肺炎支原體表面表達(dá)的脂質(zhì)配體相互作用從而達(dá)到減弱肺炎支原體生長的效果[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巴什拜羊和盤羊雜交羊rSP-A能夠在體外抑制MO生長，并且隨著SP-A濃度的升高，抑制MO生長的效果越顯著。該結(jié)果與Piboonpocanun的研究結(jié)果相似。

2.2 MO 16S rRNA熒光定量PCR檢測結(jié)果 熒光定量PCR檢測后獲得各樣品Ct值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式y(tǒng)=-3.3011x+41.68，R2=0.9957，計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組和對照組MO 16S rRNA基因拷貝數(shù)。結(jié)果顯示：與對照組相比，兩種羊的rSP-A與MO菌液共培養(yǎng)2 h時(shí)各實(shí)驗(yàn)組16S rRNA基因拷貝數(shù)均下降，且隨著蛋白濃度的升高，該拷貝數(shù)越低；4 h時(shí)下降至最低，此時(shí)，加入巴什拜羊rSP-A的實(shí)驗(yàn)A、B、C組MO 16S rRNA基因拷貝數(shù)比對照組下降了 72.15%(p＜0.05)、78.81%(p＜0.01)。作用 4 h時(shí)，加入盤羊雜交羊rSP-A的實(shí)驗(yàn)A、B、C組MO 16SrRNA基因拷貝數(shù)比對照組下降了26.26%(p＞0.05)、76.62%(p＜0.01)、80.83%(p＜0.01)，8 h 后各實(shí)驗(yàn)組該基因拷貝數(shù)開始上升，但仍然顯著低于對照組(圖2、圖3)。12 h、18 h、24 h各實(shí)驗(yàn)組該基因拷貝數(shù)繼續(xù)升高，但各組之間均出現(xiàn)了極顯著的差異，24 h時(shí)加入巴什拜羊rSP-A的實(shí)驗(yàn)A、B、C組MO 16S rRNA基因拷貝數(shù)與對照組相比分別下降了57.65%(p＜0.01)、74.12%(p＜0.01)、89.73%(p＜0.01)；加入盤羊雜交羊rSP-A的實(shí)驗(yàn)A、B、C組MO 16S rRNA基因拷貝數(shù)比對照組下降了58.7%(p＜0.01)、74.26%(p＜0.01)、88.94%(p＜0.01)。該結(jié)果表明，rSP-A能夠明顯抑制MO 16S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平，并且rSP-A在10 μg/mL～40 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。且rSP-A對MO 16S rRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響在巴什拜羊與盤羊雜交羊兩個(gè)品種之間并無顯著差異。

本研究從綿羊SP-A基因入手，得出了綿羊rSP-A蛋白具有抑制MO生長的生物學(xué)功能的結(jié)果。為今后研發(fā)治療綿羊支原體肺炎的藥物提供了參考依據(jù)，也為進(jìn)一步研究盤羊雜交羊易感MO的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。