劉 冉，黃萌萌，陳 平，朱金魯，謝 芳，劉思國(guó)，張躍靈

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069)

豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，不僅引起豬的腦膜炎、敗血癥和死亡，還導(dǎo)致人的嚴(yán)重感染和死亡，是一種重要的人獸共患病病原[1-3]。雖然早在1954年就發(fā)現(xiàn)S.suis感染，但對(duì)它的研究一直處于停滯狀態(tài)。近年來(lái)，由于重復(fù)發(fā)生S.suis致死性感染，對(duì)S.suis致病因子和致病機(jī)制的研究又成為了研究熱點(diǎn)。

目前S.suis研究所需的遺傳操作工具和技術(shù)嚴(yán)重不足，其中有效驅(qū)動(dòng)蛋白表達(dá)的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子，就是重要的遺傳操作工具之一。這種啟動(dòng)子在高水平表達(dá)GFP用于標(biāo)記菌體，以及構(gòu)建無(wú)啟動(dòng)子基因的回復(fù)突變菌株中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-5]。目前借鑒其它鏈球菌的結(jié)果，采用TufA(翻譯延伸因子EF-Tu)同源蛋白的啟動(dòng)子PtufA，用于S.suis研究[6]。但是，一種啟動(dòng)子不是用于表達(dá)所有蛋白質(zhì)的“靈丹妙藥”，需要篩選與PtufA相當(dāng)或更強(qiáng)的S.suis啟動(dòng)子，為將來(lái)S.suis致病因子和致病機(jī)制的研究提供更多的選擇。

由于蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度能夠反映相應(yīng)啟動(dòng)子的強(qiáng)度，因此本研究通過(guò)對(duì)S.suis蛋白組分進(jìn)行SDS-PAGE，選擇高豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，克隆相應(yīng)啟動(dòng)子并鑒定其驅(qū)動(dòng)GFP和SSU05_1921蛋白表達(dá)的能力。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料S.suis2型05ZYH33菌株為2005年中國(guó)四川流行分離株[7]；E.coli菌株MC1061F-購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pSET2由Daisuke Takamatsu教授惠贈(zèng)；Todd-Hewitt broth(THB)培養(yǎng)基和 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司(美國(guó))；變?nèi)芫?Mutanolysin fromStreptomyces globisporusATCC 21553)購(gòu)自 Sigma公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Cycle-Pure Kit、Plasmid Mini Kit和 Gel Extraction DNA Kit購(gòu)自 Omega公司；TIA Namp Bacteria DNA Kit購(gòu)自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；小鼠抗GFP抗體購(gòu)自Abcam公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗SSU05_1921血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 本研究所用引物由哈爾濱博仕生物公司合成(表1)。

1.3S.suis菌體組分制備和蛋白質(zhì)鑒定 取40 mL對(duì)數(shù)后期S.suis05ZYH33(OD600nm=1.0)菌體離心，收集上清液并濃縮至400 μL，該部分為分泌蛋白組分。菌體沉淀重懸于400 μL含有溶菌酶(1 mg/mL)和變?nèi)芫?250 U/mL)的TE-蔗糖緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1 mmol/L EDTA，20%蔗糖)中，37℃孵育2 h，10 000 r/min離心5 min，上清部分為胞壁蛋白。沉淀重懸于400 μL PBS緩沖液，超聲處理以完全裂解原生質(zhì)體，這部分這為細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)蛋白。上述組分進(jìn)行SDS-PAGE后切取5個(gè)高表達(dá)蛋白質(zhì)條帶，送樣BGI tech公司(中國(guó)北京)，通過(guò)MALDI-TOF/TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性鑒定。

1.4 不同啟動(dòng)子融合gfp或甘露糖苷酶ssu05_1921基因的載體構(gòu)建 采用SoftBerry軟件的BPROM程序(http://www.softberry.com/)分析獲得的高豐度蛋白基因的啟動(dòng)子序列。采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取S.suis05ZYH33的基因組DNA；由BGI tech公司合成gfp基因(KF410617)。利用表1中對(duì)應(yīng)的引物，通過(guò)重疊延伸PCR將啟動(dòng)子與gfp或ssu05_1921基因融合。首先以Pro-F0177和Pro-R0177為引物，以05ZYH33基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得P0177啟動(dòng)子片段。再以GFP-F0177和GFP-R為引物，以合成的gfp基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增獲得gfp0177片段?；厥諉?dòng)子片段P0177和gfp0177片段，混合后作為模板，以Pro-F0177和GFP-R為引物，PCR獲得啟動(dòng)子和gfp基因的融合片段P0177-gfp。采用相同方法，利用對(duì)應(yīng)引物分別經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得啟動(dòng)子和gfp基因的融合片段 P0530-gfp、P1503-gfp、P1815-gfp、P1868-gfp和P1921-gfp。融合片段經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，采用T4 DNA連接酶克隆于經(jīng)同樣雙酶切的pSET2質(zhì)粒中，分別構(gòu)建pSET2-P0177-gfp、pSET2-P0530-gfp、 pSET2-P1503-gfp、 pSET2-P1815-gfp、pSET2-P1868-gfp和pSET2-P1921-gfp。ssu05_1921基因與啟動(dòng)子的融合同上述方法相似，采用相應(yīng)引物獲得融合片段，雙酶切后克隆于到pSET2質(zhì)粒中，構(gòu)建pSET2-P0177-1921、pSET2-P0530-1921、pSET2-P1503-1921、pSET2-P1815-1921、pSET2-P1868-1921和 pSET2-P1921-1921。將上述6種重組質(zhì)粒參照說(shuō)明書采用化學(xué)轉(zhuǎn)化E.coliMC1061F-，采用文獻(xiàn)[8]報(bào)道的信息肽GE9誘導(dǎo)法轉(zhuǎn)化S.suis05ZYH33。

表1 擴(kuò)增gfp或ssu05_1921基因融合不同啟動(dòng)子所用引物

1.5 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP在E.coli和S.suis中的表達(dá) 離心收集80 mL含有不同啟動(dòng)子融合gfp的E.coli和S.suis重組菌的對(duì)數(shù)晚期菌體(OD600nm=1.0)，重懸于800 μL PBS中，超聲裂解后，以小鼠抗GFP(1∶1 000)為一抗，山羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶50 000)為二抗，采用western blot檢測(cè)GFP的表達(dá)。取E.coli對(duì)數(shù)晚期菌液(OD600nm=1.0)于LB瓊脂平板占板培養(yǎng)，在藍(lán)光下觀察GFP的表達(dá)情況；離心收集5 mLS.suis對(duì)數(shù)晚期菌體(OD600nm=1.0)，在藍(lán)光下觀察GFP的表達(dá)情況。離心收集S.suis對(duì)數(shù)晚期菌體(OD600nm=1.0)，PBS洗滌兩次，然后重懸于含4%甲醛的 PBS至濃度 1×106cfu/mL。利用 CytomicsTMFC500(貝克曼)進(jìn)行流式分析。以 10 μL/min的流速，通過(guò)對(duì)前向、側(cè)向散光和側(cè)向熒光的采集，記錄50 000個(gè)事件采用CXP軟件分析重組菌在S.suis中表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(AFI)。

1.6 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SSU05_1921在S.suis中的表達(dá) 為了進(jìn)一步評(píng)估這6個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)度，本研究將1.4中構(gòu)建的pSET2-P0177-1921、pSET2-P0530-1921、pSET2-P1503-1921、 pSET2-P1815-1921、 pSET2-P1868-1921和pSET2-P1921-1921 6種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化S.suis，超聲破碎獲得全菌蛋白，并采用兔抗SSU05_1921(1∶1 000)為一抗，山羊抗兔 IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，通過(guò)western blot檢測(cè)SSU05_1921的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1S.suis05ZYH33高豐度蛋白質(zhì)的鑒定 從S.suis05ZYH33中分離出3種菌體組分，即分泌蛋白組分，胞壁組分和胞膜/胞質(zhì)蛋白組分。通過(guò)SDSPAGE檢測(cè)，并根據(jù)蛋白豐度，同時(shí)考慮不同組分來(lái)源篩選了5個(gè)高豐度蛋白(圖1)。將上述5個(gè)高豐度蛋白送至BGI tech公司(中國(guó)北京)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定。質(zhì)譜結(jié)果顯示，分別是分泌蛋白SSU05_1815和SSU05_0177，胞壁蛋白SSU05_1868，胞內(nèi)蛋白 SSU05_1503和 SSU05_0530(表 2)。巧合的是，ssu05_0530基因的啟動(dòng)子正是目前在鏈球菌中使用的強(qiáng)啟動(dòng)子PtufA，在本研究中除了對(duì)其進(jìn)行鑒定外，也將其用作強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)照。

表2 質(zhì)譜鑒定的S.suis05ZYH33高豐度蛋白

2.2 高豐度蛋白及甘露糖苷酶SSU05_1921的基因啟動(dòng)子分析 SoftBerry軟件分析上述高豐度蛋白的基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，在所有基因的上游均發(fā)現(xiàn)了-35區(qū)和-10區(qū)，ssu05_0177基因上游則發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)-35區(qū)和-10區(qū)。取-35區(qū)上游至少103 bp至基因起始密碼子區(qū)域?yàn)閱?dòng)子序列進(jìn)行克隆，對(duì)ssu05_0177基因，則將兩個(gè)-35區(qū)和-10區(qū)均包括在內(nèi)。根據(jù)其基因編號(hào)，這些啟動(dòng)子分別命名為P0177、P0530、P1503、P1815和P1868。另外，之前報(bào)道甘露糖苷酶SSU05_1921的同源蛋白在肺炎鏈球菌中檢測(cè)不到[9]，本研究在S.suis中也檢測(cè)不到，初步估計(jì)ssu05_1921是弱啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖2)。

2.3 啟動(dòng)子與gfp基因、ssu05_1921基因的融合利用重疊延伸PCR構(gòu)建融合片段P0177-gfp(1 201 bp)、P0530-gfp(1017bp)、P1503-gfp(914bp)、P1815-gfp(1069bp)、P1868-gfp(974 bp)和 P1921-gfp(1 079 bp)、P0177-1921(2 614 bp)、P0530-1921(2 430 bp)、P1503-1921(2 327 bp)、P1815-1921(2 482 bp)、P1868-1921(2 387 bp)和 P1921-1921(2 492 bp)，PCR鑒定結(jié)果顯示融合片段大小均與預(yù)期相符(圖3)。將融合目的片段克隆于pSET2載體中，經(jīng)測(cè)序分析融合位置正確，表明獲得了不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp基因和不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ssu05_1921基因的共12種重組表達(dá)質(zhì)粒。將不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp基因的6種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coli和S.suis獲得相應(yīng)重組菌株。將不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ssu05_1921基因轉(zhuǎn)化至S.suis獲得相應(yīng)重組菌株。

2.4 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP在E.coli和S.suis中的表達(dá) 利用western blot檢測(cè)不同啟動(dòng)子對(duì)GFP表達(dá)的驅(qū)動(dòng)作用，結(jié)果顯示6個(gè)啟動(dòng)子均可以在E.coli中驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)，但效率存在顯著差異。P1921驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)量非常低，難以檢測(cè)，與它是弱啟動(dòng)子的預(yù)期符合。而高豐度蛋白的啟動(dòng)子P0177、P0530、P1503、P1815、P1868均能夠高效驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，其驅(qū)動(dòng)水平均高于或相當(dāng)于P0530(圖4A，上)。藍(lán)光觀察與 western blot結(jié)果一致，啟動(dòng)子 P0177、P0530、P1503、P1815和P1868驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)均能夠在菌體中明顯表現(xiàn)出(圖4A，下)。在S.suis中的表達(dá)情況則與E.coli中略有不同，P0177、P1503和P1868仍保持和P0530相當(dāng)或更高的驅(qū)動(dòng)水平，P1815驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)在S.suis中則顯著弱于P0530，P1921驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)在S.suis中經(jīng)western blot完全檢測(cè)不到(圖4B，上)，藍(lán)光觀察與western blot結(jié)果一致(圖4B，下)。為了進(jìn)一步量化GFP表達(dá)的差異，本研究采用流式分析檢測(cè)并分析了重組菌在S.suis中表達(dá)的AFI。結(jié)果顯示，AFI值與每個(gè)啟動(dòng)子的western blot檢測(cè)的強(qiáng)度一致，其中 pSET2-P1503-gfp/S.suis的 AFI(15.80)是 pSET2-P0530-gfp/S.suis(7.68)的兩倍(圖 4C)。

通過(guò)3種方法檢測(cè)不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP在E.coli和S.suis中的表達(dá)，結(jié)果一致。表明P1503無(wú)論在E.coli還是在S.suis中均是6個(gè)啟動(dòng)子中表現(xiàn)最強(qiáng)的啟動(dòng)子。

2.5 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SSU05_1921在S.suis中的表達(dá) 利用western blot檢測(cè)不同啟動(dòng)子對(duì)SSU05_1921表達(dá)的驅(qū)動(dòng)作用。結(jié)果顯示，即使存在基因組和質(zhì)粒雙拷貝的情況下，P1921也不能驅(qū)動(dòng)SSU05_1921在S.suis中的表達(dá)，表明其為弱啟動(dòng)子。P1815驅(qū)動(dòng)SSU05_1921的表達(dá)也未檢測(cè)到。而P0177和P1868雖然能夠驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，且強(qiáng)度與P0530相當(dāng)，但對(duì)SSU05_1921的驅(qū)動(dòng)卻很弱，未檢測(cè)到SSU05_1921的表達(dá)。P1503和P0530均能夠驅(qū)動(dòng)SSU05_1921的表達(dá)，但強(qiáng)度存在明顯差異，P1503驅(qū)動(dòng)SSU05_1921的表達(dá)量高于P0530驅(qū)動(dòng)其的表達(dá)量3倍以上(圖5)。結(jié)果再次表明P1503是6個(gè)啟動(dòng)子中表現(xiàn)最強(qiáng)的啟動(dòng)子。

3 討論

強(qiáng)啟動(dòng)子是很重要的遺傳操作元件。為了篩選和鑒定S.suis2型05ZYH33的強(qiáng)啟動(dòng)子，本研究通過(guò)質(zhì)譜鑒定到了5種高豐度蛋白。其中分泌蛋白SSU05_1815與真核轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同源，被證明是S.suis的重要毒力因子[10]。分泌蛋白SSU05_0177 C-末端顯示出與格式鏈球菌(Streptococcus gordonii)的毒力因子粘附素GspB有29%的同源性，提示SSU05_0177可能是S.suis的毒力因子[11]。SSU05_1868是寡肽通透酶OppA組分，介導(dǎo)肽的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。SSU05_0530為翻譯延伸因子，在蛋白質(zhì)合成中具有重要作用[13]。SSU05_1503是烯醇化酶，也稱為磷酸丙酮酸水合酶，在糖酵解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。正是這些蛋白質(zhì)的重要性決定了其在S.suis中要采用強(qiáng)啟動(dòng)子高水平的表達(dá)。

P1921被預(yù)測(cè)為弱啟動(dòng)子，本研究證實(shí)其在E.coli中驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的能力很弱，在S.suis中則完全不能驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)，這提示它在S.suis中還有受到抑制調(diào)控的可能。這種抑制調(diào)控也體現(xiàn)在P1815上，因?yàn)镻1815在E.coli中驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的能力與其它高豐度蛋白的啟動(dòng)子相當(dāng)，在S.suis中卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它啟動(dòng)子。另外，同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)不同蛋白表達(dá)的能力還存在顯著不同，比如P0177、P1503和P1868在E.coli和S.suis中能夠有效驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，卻不能驅(qū)動(dòng)SSU05_1921的表達(dá)，提示需要采用不同的目的基因評(píng)估一個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。

對(duì)于啟動(dòng)子P0530，獲得了看似矛盾的結(jié)果。本研究嘗試了文獻(xiàn)報(bào)道的方法，采用酶切連接P0530和ssu05_1921基因，但不能檢測(cè)到SSU05_1921的表達(dá)，而采用重疊延伸PCR策略，則檢測(cè)到了SSU05_1921的表達(dá)。推測(cè)可能是在P0530和ssu05_1921基因之間引入的酶切位點(diǎn)削弱了P0530的驅(qū)動(dòng)能力，而重疊延伸策略則避免了在啟動(dòng)子和gfp基因之間引入任何額外的核苷酸，這提示應(yīng)謹(jǐn)慎考慮將任何異源基因序列引入啟動(dòng)子和目的基因之間。

另外，本研究目前僅探究了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下啟動(dòng)子的強(qiáng)弱情況，雖然對(duì)體外遺傳操作具有較好的指導(dǎo)意義，但如果用于細(xì)胞和宿主體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)，還需要針對(duì)豬鏈球菌可能遇到的環(huán)境條件，深入研究不同條件下啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)能力。

綜上，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，本研究證實(shí)P0530和P1503在S.suis中均為強(qiáng)啟動(dòng)子，而且P1503強(qiáng)度至少兩倍于P0530。因此，除了目前使用的P0530，P1503是S.suis中強(qiáng)啟動(dòng)子的新選擇。此外，由于烯醇酶在鏈球菌中非常重要和保守，其啟動(dòng)子也可能是其它鏈球菌中非常有潛力的遺傳操作工具。