張黎黎， 呂 軍， 楊 薈， 付 莎， 李勁高， 黃 蓉， 宛 霞， 徐安平

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510210)

一直以來，腎纖維化被認為是多種慢性腎疾病進展至終末期腎病的病理損傷過程，它與腎功能障礙和最終器官衰竭密切相關，但是目前仍然沒有有效干預手段以阻止腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。盡管投入了大量的研究工作，腎纖維化是如何產(chǎn)生的仍頗具爭議性[2-3]，而其中腎小管上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是導致腎纖維化發(fā)生的機制之一[4]。在EMT過程中，上皮細胞會失去自身的特性而獲得基質細胞的特點，如細胞形態(tài)改變；波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等表達增加，細胞遷移能力增強；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達減少，細胞間連接下降；細胞外基質蛋白，如纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等表達增加[5]。幾乎每一種腎損傷都會不同程度地誘導腎小管上皮細胞經(jīng)歷EMT的不同階段從而導致纖維化，但是EMT是如何參與腎纖維化的進程及其具體分子機制尚知之甚少，這意味著對EMT的充分了解將會使我們?yōu)槟I纖維化更好地提出有效的干預策略。

最近有研究表明一些特異的微小RNA(micro-RNA，miRNA，miR)在組織的纖維化進程中扮演著至關重要的角色[6-7]。miRNA是一類由長約20～25 nt的單鏈非編碼RNA，它主要通過抑制靶基因的翻譯在轉錄后水平調控靶基因的表達[8]。miR-10前體家族成員編碼了一系列短非編碼RNA，它們廣泛參與到基因的調控過程中[9],其中，miR-10b是維甲酸誘導的細胞分化事件中的關鍵調控子[10]。除此之外，miR-10b也被證實可以通過促進細胞的增殖、侵襲以及遷移等過程參與腫瘤生成，包括低級別膠質瘤和乳腺癌等[11-13],這些事件與EMT有很多共同的調控分子，比如生長分化因子15(growth differentiation factor 15, GDF15)可以同時促進轉移和EMT[14]；Ski可以參與細胞的侵襲和EMT[15],基于以上研究，我們推測miR-10b很可能在EMT進程中發(fā)揮著重要的作用，且其潛在的機制也有待深入研究。

在本研究中，我們檢測了2型糖尿病合并腎纖維化患者腎組織樣本中的miR-10b表達水平，并在體外實驗中研究了miR-10b是否參與了高糖誘導的腎小管上皮細胞的EMT，并對其相關機制進行了探索，以期為糖尿病腎病腎纖維化的有效治療提供潛在的候選靶點。

材 料 和 方 法

1 實驗試劑

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM-F12培養(yǎng)基購自Gibco；SuperReal PreMix試劑盒購自北京天根公司；RNAiso Plus試劑盒、TRIzol試劑盒和M-PER試劑盒購自Life Technologies；Lipofectamine 2000轉染試劑和Lipofectamine RNAiMAX試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；BCA法蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司；miR-10b 模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)購自廣東瑞博生物公司；抗FN、SLUG、KLF10和β-actin抗體購自Abcam；抗N-cadherin、p-Smad3和轉化生長因子β(transforming growth facton-β,TGF-β)抗體購自CST；抗SNAI1抗體購自Proteintech；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega。

2 臨床樣本

10例癌旁腎組織來自病理科留存的腎癌切除術后癌旁正常腎組織(經(jīng)病理科檢驗為正常腎組織)；10例腎病患者腎組織來自于經(jīng)腎穿刺檢測的2型糖尿病合并腎纖維化患者腎組織，該項實驗經(jīng)過患者知情同意。實驗經(jīng)過中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準。

3 方法

3.1細胞培養(yǎng)與高糖誘導腎小管上皮細胞EMT模型的建立 人永生化腎小管上皮細胞HK-2購自ATCC。細胞在含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、95%相對濕度，Thermo 3111型37 ℃恒溫密閉式細胞培養(yǎng)箱中。采用30 mmol/L D-葡萄糖分別作用于HK-2細胞0、12、24和48 h，建立高糖誘導腎小管上皮細胞EMT模型。

3.2瞬時轉染實驗 HK-2細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，靜置貼壁后以Lipofectamine RNAiMAX轉染KLF10過表達質粒、miR-10b mimic和inhibitor，亂序RNA片段作為對照，12 h后更換含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基并給予高糖刺激相應時間。具體步驟如下：先向250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中加入相應濃度片段，再向250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中加入Lipofectamine RNAiMAX 5 μL，然后將上述稀釋好的Lipofectamine RNAiMAX和miR-10b mimic或inhibitor片段混合，室溫靜置5 min；將混合物滴加到所需轉染培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)基體積為2.5 mL)，最終培養(yǎng)體系為3 mL。

3.3RT-qPCR實驗 對于組織：取適量樣本組織加入1 mL RNAiso Plus至勻漿器進行勻漿，液體澄清后轉移至1.5 mL離心管中，室溫靜置5 min后，按照說明書提取組織總RNA。對于細胞：當細胞生長至對數(shù)期時，以每孔2×105密度接種于6孔板中，貼壁后給予相應處理。處理結束后除去上清，按照說明書每孔中加入1 mL TRIzol試劑提取細胞RNA?？俁NA經(jīng)Qubit 2.0熒光計測定濃度后，以1 μg總RNA進行逆轉錄反應，PCR參數(shù)為42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min以終止逆轉錄反應。cDNA按照SuperReal PreMix試劑盒說明書操作，與引物一起進行實時定量PCR實驗。miRNA-10b的上游引物序列為5’-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3’， 下游引物序列為5’-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3’； U6的上游引物序列為5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’， 下游引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。設置PCR參數(shù)為:95 ℃ 10 min； 95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進行40個循環(huán)，緩慢升溫至95 ℃。反應結束后，按照2-ΔΔCt法計算miR-10b的相對表達量。

3.4Western blot法檢測蛋白表達 HK-2細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)過各組處理至相應時間后去除上清，預冷PBS輕柔洗滌3次。每孔加入200 μL細胞裂解液，按照M-PER試劑盒說明書提取細胞總蛋白，之后利用BCA法試劑盒測定蛋白濃度。蛋白定量至相同濃度后，取蛋白樣品20 μg，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液并在沸水中煮5 min使蛋白徹底變性。之后行SDS-PAGE分離；濕轉法轉移到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入稀釋后的 I 抗(抗體稀釋液為5% BSA)，4 ℃孵育過夜；次日用TBST 洗滌3次，每次5 min，加入相應 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后利用化學發(fā)光法顯色拍照。

3.5雙螢光素酶報告基因實驗 將KLF10基因3’-UTR克隆至pGL3質粒以構建pGL3-KLF10野生型載體和突變型載體。HK-2細胞接種于12孔板中，靜置貼壁后以Lipofectamine 2000按照實驗設計共轉染pGL3-KLF4野生型載體或突變型載體以及miR-10b模擬物。24 h后，根據(jù)雙螢光素酶報告基因實驗試劑盒說明書利用Synergy H1型多功能酶標儀檢測螢火蟲螢光素酶活性，以海腎螢光素酶活性作為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 6 軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有實驗均進行3次或者3次以上，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組或多組定量資料在滿足正態(tài)分布和方差齊的條件下，分別采用雙側t檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA)方法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-10b在腎纖維化組織中高表達

癌旁正常腎組織和2型糖尿病合并腎纖維化患者腎組織中miR-10b表達的分析結果顯示，在2型糖尿病合并腎纖維化患者腎組織樣本中，miR-10b的表達水平較正常對照組顯著增加(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression level miR-10b was up-regulated in the tissues from type 2 diabetes patients with kidney fibrosis. The relative expression level of miR-10b in para-carcinoma normal tissues(PC) and type 2 diabetes patients with kidney fibrosis (KD) tissues were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsPC group.

圖1 在2型糖尿病合并腎纖維化患者腎組織中miR-10b的表達增加

2 miR-10b在高糖刺激的HK-2細胞中高表達

30 mmol/L D-葡萄糖分別作用于HK-2細胞0、12、24和48 h后，可時間依賴性地促進miR-10b的表達，其中刺激24 h和48 h后，miR-10b的表達較正常對照組顯著上調(P<0.01)，見圖2A。進一步利用30 mmol/L甘露醇作用于HK-2細胞48 h，miR-10b的表達并沒有改變，見圖2B。 結果說明，本研究排除了滲透壓改變，miR-10b表達上調是高糖引起的。

3 下調miR-10b抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT

HK-2細胞轉染miR-10b inhibitor 24 h后，給予30 mmol/L D-葡萄糖刺激48 h，觀察細胞形態(tài)變化和EMT標志蛋白表達改變。結果顯示，正常對照(normal control, NC)組HK-2細胞呈現(xiàn)鵝卵石形狀，高糖(high glucose,HG)組細胞表現(xiàn)為成纖維細胞樣的長條形，而miR-10b inhibitor預處理可以抑制由高糖刺激誘導的細胞形態(tài)學改變，見圖3A。同時，與NC組相比，高糖刺激可誘導EMT的分子標志蛋白fibronectin、SLUG、N-cadherin和SNAI1上調(P<0.01)；與高糖組相比，miR-10b inhibitor預處理可抑制高糖誘導的EMT分子指標表達(P<0.01),見圖3B。

Figure 2.The expression level of miR-10b was up-regulated in high glucose-stimulated HK-2 cells in a time-dependent manner (A), however, 30 mmol/L mannitol had none affect on miR-10b expression (B). The relative expression of miR-10b in each treatment group was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h group.

圖2 高糖刺激以時間依賴的方式誘導HK-2細胞中miR-10b表達上調

Figure 3.Downregulation of miR-10b inhibited high glucose-induced EMT in renal tubular epithelial cells. A: the morphological changes of HK-2 cells were observed by microscope (scale bar=20 μm); B: the expression levels of indicated EMT markers were detected by Western blot. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖3 下調miR-10b抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT

4 miR-10b可直接作用于KLF10并抑制其表達

通過在線數(shù)據(jù)庫miRBase對miR-10b的靶點進行預測，結果顯示KLF10(Krüppel-like transcription factor 10)是miR-10b的一個結合靶點，見圖4A。進一步在HK-2細胞轉染miR-10b mimic或inhibitor，檢測KLF10表達水平，結果顯示在轉染miR-10b mimic之后，KLF10的表達顯著下降(P<0.01)；而在轉染miR-10b inhibitor后，KLF10的表達明顯增加(P<0.01),見圖4B、C。為了進一步驗證KLF10是否為miR-10b的直接作用靶點，在pGL3載體中克隆入KLF10 3’-UTR的野生型和突變型，結果顯示，在共轉染pGL3-KLF10野生型質粒與miR-10b前體質粒時，螢光強度被明顯抑制(P<0.01)；而與miR-10b結合區(qū)域被突變后，螢光強度與正常水平類似，見圖4D。這些結果提示miR-10b可直接作用于KLF10并抑制其表達。

Figure 4.miR-10b directly targeted KLF10 mRNA and negatively regulated its expression. A: schematic representation of KLF 3’-UTR showing putative miR-10b binding site; B and C: miR-10b mimic inhibited KLF10 expression, whereas inhibitor augmented KLF10 expression; D: relative luciferase activity of KLF10-WT and KLF10-mutant. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vsNC group.

圖4 miR-10b直接作用于KLF10并抑制其表達

5 KLF10過表達抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT

為研究KLF10對腎小管上皮細胞EMT的直接作用，用KLF10過表達質粒轉染HK-2細胞，24 h后再用高糖刺激48 h，分析KLF10對EMT的影響，結果顯示，KLF10過表達可以逆轉由高糖誘導的HK-2細胞的形態(tài)學改變，見圖5A，并顯著抑制fibronectin、SLUG、N-cadherin和SNAI1的表達(P<0.01),見圖5B。這些結果提示KLF10過表達抑制腎小管上皮細胞的EMT。

Figure 5.KLF10 over-expression reversed high glucose-induced EMT in HK-2 cells. A: the morphological changes of HK-2 cells were examined by microscope (scale bar=20 μm); B: the expression levels of EMT markers were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖5 過表達KLF10可以逆轉高糖刺激誘導的HK2細胞EMT

6 KLF10過表達抑制TGF-β/Smad3激活

Western blot結果顯示,高糖可誘導TGF-β/Smad3通路激活，而KLF10過表達抑制高糖誘導的TGF-β/Smad3通路激活(P<0.01),見圖6A,該結果與圖5結果共同說明KLF10通過抑制TGF-β/Smad3信號通路，抑制腎小管上皮細胞EMT。接下來，進一步研究miR-10b對EMT的促進作用是否由KLF10/TGF-β/Smad3通路所介導,直接在HK-2細胞中轉染miR-10b mimic可顯著增強TGF-β/Smad3通路活性，而KLF10過表達可逆轉miR-10b的作用(P<0.01),見圖6B。以上結果共同說明miR-10b促進高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT的作用是通過KLF10/TGF-β/Smad3信號通路介導的。

Figure 6.KLF10 over-expression inhibited EMT by suppression of TGF-β/Smad3 signaling pathway. A: KLF10 over-expression reversed high glucose-stimulated TGF-β/Smad3 activation; B: KLF10 over-expression inhibited miR-10 mimic-induced TGF-β/Smad3 activation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsNC group;△△P<0.01vsmiR-10b mimic group.

圖6 KLF10過表達通過抑制TGF-β/Smad3信號通路逆轉EMT

討 論

研究表明腎小管上皮細胞EMT在腎纖維化過程中扮演著重要的角色[16]，除此之外，眾多研究者在多種模型中也發(fā)現(xiàn)抑制EMT可以有效減輕腎纖維化的發(fā)生[17-19]。這些研究背景從不同層面表明了EMT在腎纖維化過程中的重要性。在這些研究中，miRNAs在EMT事件中所扮演的角色一直受到人們的關注。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖誘導的HK-2細胞纖維化過程中miR-10b表達上調，且抑制miR-10b能部分抑制高糖誘導的HK-2細胞纖維化。進一步研究發(fā)現(xiàn)KLF10是miR-10參與高糖誘導的HK-2細胞纖維化過程中的直接靶點，miR-10b是通過下調KLF10來完成促進高糖誘導的HK2細胞纖維化的。KLF10是一個含有鋅指蛋白結構域的轉錄因子，TGF-β是它一個早期應答基因[20]。大量研究表明TGF-β/Smad3在腎纖維化的EMT中扮演著重要的角色[20-22]。因此本研究探討KLF10是否通過TGF-β/Smad3通路影響腎小管上皮細胞EMT。我們發(fā)現(xiàn)miR-10b可以通過抑制KLF10的表達從而促進EMT進程；同時，miR-10b表達也促進TGF-β/Smad3的激活。同樣在肺癌細胞A549的研究中表明KLF10可以通過占據(jù)促EMT轉錄因子SLUG啟動子中的GC高含量區(qū)域，從而抑制HDAC1的招募導致SLUG的下調表達，這些事件協(xié)同作用阻礙了EMT的進程[23]。與此結果一致，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)KLF10的上調表達可以抑制包括SLUG在內(nèi)的一些促EMT轉錄因子的表達，同時也可抑制EMT的發(fā)生。除此之外，KLF10的高表達也可以抑制促EMT轉錄因子SNAI1的表達。但是KLF10是通過何種作用機制使得它們的表達受到影響還需要我們進一步證明?？偠灾?，我們的結果證明了KLF10是miR-10b介導的EMT事件中不可缺少的一環(huán)。

綜上所述，我們的研究表明miR-10b可通過直接抑制KLF10的表達從而促進高糖刺激的腎小管上皮EMT。miR-10b在糖尿病腎病腎纖維化的診斷與治療中有望成為一個有潛力的候選靶點。