馮湘沅，成莉鳳，劉正初，楊琦，劉志遠，鄭科，段盛文，彭源德

(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南長沙410205)

苧麻是我國生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)最具發(fā)展?jié)摿Φ幕A材料之一，其纖維包裹于植株的韌皮部，通過剝皮和刮制獲得的產(chǎn)品含有22%～30%的非纖維素物質(zhì)，經(jīng)脫膠后才能分離出纖維[1-3]。國內(nèi)外對苧麻韌皮脫膠普遍采用以燒堿煮煉為中心的化學方法，但由于存在環(huán)境污染重，水量消耗大，纖維品質(zhì)損傷嚴重等問題，制約了產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展。生物脫膠具有低能耗、低污染、高品質(zhì)等特點，是苧麻脫膠的發(fā)展方向[4-5]。英國牛津大學、日本早稻田大學、中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所、武漢大學、華中農(nóng)業(yè)大學等進行了生物脫膠研究，并取得了實質(zhì)性突破。但由于微生物酶法脫膠存在高成本、難控制等缺陷[6]，很難得到規(guī)?；茝V，而菌脫膠缺乏優(yōu)良的脫膠菌株及匹配的脫膠工藝，導致目前菌脫膠尚未形成穩(wěn)定性生產(chǎn)應用[7-9]。

本文擬采用具有廣譜、高效性的DCE01菌株，以濕潤、浸泡發(fā)酵方式對苧麻韌皮進行生物脫膠，利用半自動纖維分析儀法和柱前衍生-高效液相色譜法對苧麻韌皮生物脫膠產(chǎn)物中半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和水解液中半乳糖醛酸的含量分別進行測定比較[10]，旨在為工廠化生物脫膠節(jié)約成本，同時為減少環(huán)境污染提供可借鑒的發(fā)酵方式。

1 材料與方法

1.1 材料

DCE01菌株:本實驗室2009年選育，Dickeya dadantii(保藏號:CGMCC5522)。

原麻:2017年長沙實驗基地種植，刮制而成的苧麻韌皮(繞成圈柄狀)。

液體培養(yǎng)基組成:蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、氯化鈉0.5%、牛肉浸膏0.5%、自來水。

固體培養(yǎng)基組成:營養(yǎng)瓊脂3.5%，葡萄糖0.5%、自來水。

1.2 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀(Dionex Ultimate 3000)，泵(LPG-3400)紫外檢測器(VWD-3400)，C18柱(Thermo Hypersil BDS，250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用變色龍軟件采集并處理數(shù)據(jù)。

FibertecTM2010半自動纖維分析儀(丹麥Foss公司)；TC-4-10型陶瓷纖維爐(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；FZ102型粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；RH-Q型全溫振蕩器(江蘇科析儀器有限公司)。

十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙二醇乙醚、磷酸氫二鈉、十六烷基三甲基溴化胺、硫酸、三氟乙酸、醋酸銨、1-苯基-3-甲基-吡啉酮(PMP)等均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品(分析純)；乙腈(色譜純)和半乳糖醛酸為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 菌液的培養(yǎng)

取1環(huán)抽真空法保存的DCE01菌苔加入5 mL液體培養(yǎng)基中，混勻，35℃、180 r/min培養(yǎng)6 h后，取1 mL培養(yǎng)液稀釋涂布于固體培養(yǎng)基平皿，35℃靜置培養(yǎng)20 h，長出菌落，挑取典型單菌落接入5 mL液體培養(yǎng)基，混勻，35℃、180 r/min培養(yǎng)4 h后，全部倒入至100 mL液體培養(yǎng)基，35℃、180 r/min培養(yǎng)5 h后，取6 mL培養(yǎng)液接入300 mL液體培養(yǎng)基，35℃、180 r/min培養(yǎng)6 h。

1.4 發(fā)酵方式

1.4.1 濕潤發(fā)酵

參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《苧麻生物脫膠技術規(guī)范(NY/T1537—2007)》，取6 mL菌液于裝有300 mL自來水的錐形瓶中，混勻，投入30 g苧麻韌皮，浸泡15 min后倒出液體，置于35℃恒溫生化培養(yǎng)箱，靜止脫膠，設置3個重復。

1.4.2 浸泡發(fā)酵

取6 mL菌液于裝有300 mL自來水的錐形瓶中，混勻，投入30 g苧麻韌皮，置于35℃、180 r/min全恒溫振蕩器，振蕩脫膠，設置3個重復。

1.5 樣品處理

苧麻韌皮接入菌液后從0.5 h開始計時直至10.5 h結束，每隔2 h取樣，取出的樣品立即經(jīng)105℃保持20 min，滅活，冷卻至室溫，取樣品用自來水清洗，烘干后獲得生物脫膠產(chǎn)物。

將烘干后的生物脫膠產(chǎn)物粉碎，過20目(0.9 mm)篩，收集粉末，測定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和半乳糖醛酸含量。

1.6 測定方法

(1)纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量測定采用FibertecTM2010半自動纖維分析儀，參照劉文靜等[11-12]測定方法進行。

(2)半乳糖醛酸含量采用柱前衍生-高效液相色譜法，參照馮湘沅等[13-14]測定方法進行。(3)脫除率計算公式為:

脫除率(%)=(脫膠產(chǎn)物初始含量-脫膠產(chǎn)物終止含量)/脫膠產(chǎn)物初始含量×100%(4)方差齊性F檢驗公式為:

2 結果與分析

2.1 半纖維素含量的變化趨勢

由圖1可知，從0.5 h開始到10.5 h結束，浸泡發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中半纖維素含量由起始測定時的16.56%下降到脫膠結束時的4.28%，下降12.28個百分點，相當于半纖維素的脫除率為74.15%；濕潤發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中半纖維素含量由16.73%下降為4.55%，下降12.18個百分點，相當于半纖維素的脫除率為72.80%。在浸泡及濕潤發(fā)酵方式脫膠中，苧麻韌皮纖維中的半纖維素含量均隨脫膠時間的延長而不斷降低，整個脫膠過程中半纖維素含量變化趨勢相似。

2.2 果膠降解產(chǎn)物-半乳糖醛酸含量的變化趨勢

由圖2可知，濕潤和浸泡發(fā)酵方式進行苧麻韌皮生物脫膠，產(chǎn)物水解液中果膠的降解產(chǎn)物-半乳糖醛酸含量均隨脫膠時間的延長而逐漸下降。半乳糖醛酸含量分別由起始0.5 h的30.46 μg/mL(濕潤)、30.59 μg/mL(浸泡)下降到 10.5 h 的 5.03 μg/mL(濕潤)、4.93 μg/mL(浸泡)，相當于苧麻韌皮中果膠的脫除率分別為83.49%(濕潤)和83.88%(浸泡)。

從圖1、2可以看出，2.5 h前兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中的半纖維素和半乳糖醛酸含量無明顯差異，2.5～6.5 h發(fā)酵期間，浸泡發(fā)酵方式脫膠速度明顯比濕潤發(fā)酵方式快，但6.5 h后兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中的半纖維素和半乳糖醛酸含量幾乎接近。這說明DCE01菌株在濕潤和浸泡發(fā)酵方式脫膠過程中均能分泌果膠酶、甘露聚糖酶等脫膠關鍵酶，從而降解非纖維素物質(zhì)，且在6.5 h左右順利完成脫膠。

圖1 苧麻韌皮兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中半纖維素含量的變化趨勢Fig.1 Change trend of hemicellulose content during ramie degumming by two fermentation methods

圖2 苧麻韌皮兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中半乳糖醛酸含量的變化趨勢Fig.2 Change trend of galacturonic acid content during ramie degumming by two fermentation methods

2.3 木質(zhì)素含量的變化趨勢

由圖3可知，兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中木質(zhì)素含量均隨脫膠時間的延長而不斷下降。浸泡發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中木質(zhì)素含量由起始的0.89%下降到脫膠終止時的0.11%，相當于木質(zhì)素的脫除率為87.64%；濕潤發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中木質(zhì)素含量則由起始的0.91%下降到終止時的0.13%，相當于木質(zhì)素的脫除率為85.71%。這一結果為證實劉正初等[7]創(chuàng)立的“塊狀崩潰”學說提供了科學依據(jù)。雖然沒有報道DCE01菌株分泌木質(zhì)素酶，但是在兩種發(fā)酵方式脫膠過程中可大幅度降低脫膠產(chǎn)物中木質(zhì)素的含量。

圖3 苧麻韌皮兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中木質(zhì)素含量的變化趨勢Fig.3 Change trend of lignin content during ramie degumming by two fermentation methods

2.4 纖維素含量的變化趨勢

由圖4可知，浸泡和濕潤發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物中纖維素含量均隨脫膠時間的延長而不斷增加。苧麻韌皮纖維中纖維素含量由0.5 h的71.15%(浸泡)、71.07%(濕潤)上升到10.5 h的91.88%(浸泡)、91.56%(濕潤)。這說明苧麻韌皮接種DCE01菌液后，兩種發(fā)酵方式生物脫膠過程中可將半纖維素、果膠和木質(zhì)素等膠質(zhì)逐漸剝離，使得生物脫膠產(chǎn)物中纖維素含量上升。

2.5 顯著性檢驗

在選用顯著水平α=0.05情況下，分別對浸泡和濕潤發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物的化學成分(表1)半纖維素、半乳糖醛酸、木質(zhì)素下降值及纖維素上升值進行方差齊性F檢驗(表2)，檢驗結果均滿足F樣＜F0.05(2.2)，表明兩種發(fā)酵方式脫膠效果差異不顯著。

表1 兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物的化學成分變化趨勢Table 1 The change trend of chemical contends by two fermentation methods

表2 方差齊性F檢驗數(shù)據(jù)處理Table 2 The treatment of variance F test data

3 結論

利用DCE01菌株以浸泡和濕潤發(fā)酵方式對苧麻韌皮進行生物脫膠，結果表明:隨著脫膠時間的延長，兩種發(fā)酵方式對苧麻韌皮纖維進行生物脫膠均能使生物脫膠產(chǎn)物中的半纖維素、木質(zhì)素、果膠降解產(chǎn)物-半乳糖醛酸含量不斷降低，纖維素含量不斷增加，變化趨勢雷同。接種6.5 h后的果膠、半纖維素、木質(zhì)素和纖維素含量的變化相對平緩，可以認為此時生物脫膠過程已經(jīng)完成。

浸泡發(fā)酵方式脫膠是將苧麻韌皮浸泡在菌懸液中通過振蕩方式發(fā)酵進行，而濕潤發(fā)酵方式脫膠是苧麻韌皮接種倒出菌懸液后通過靜止發(fā)酵方式進行。兩種發(fā)酵方式脫膠產(chǎn)物的化學成分變化值經(jīng)方差齊性F檢驗數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)脫膠效果無明顯區(qū)別?；谶@一結果可以推斷，生產(chǎn)上采用濕潤發(fā)酵方式更經(jīng)濟，因為浸泡發(fā)酵方式需要通氣完成，可能會導致脫膠過程能源消耗更大。