蘇小惠，白玉超，3#，佘瑋，2，楊瑞芳，2，崔丹丹，李林林，王繼龍，崔國(guó)賢，2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；3.深圳市芭田生態(tài)工程股份有限公司，廣東深圳518105)

苧麻(Boehmeria niveaL.)屬蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)，是一種多年生宿根性草本纖維植物[1]。苧麻地下部分俗稱(chēng)“麻蔸”，包括根系和地下莖。在土壤中，根系分泌物和根際微生物間的相互作用是十分重要的過(guò)程，植物根系通過(guò)分泌各種次生代謝物質(zhì)對(duì)根際微生物的種類(lèi)、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響，對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有選擇塑造作用[2]。Eisenhauer等[3]的研究表明，根系分泌物介導(dǎo)下的植物-微生物互作關(guān)系變化對(duì)于土壤肥力、健康狀況以及植物生長(zhǎng)發(fā)育有著極其重要的作用。Berendsen等[4]認(rèn)為，根際是植物體的一個(gè)組成部分，根際微生物群落的宏基因組是植物體的第二基因組。吳林坤等[2]認(rèn)為，植物的他感作用、連作障礙、連作促進(jìn)或是間套作增產(chǎn)等，均是由其根系分泌物介導(dǎo)下的植物與特異微生物共同作用的結(jié)果。Gschwendtner等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同的馬鈴薯品種之間根際微生物群落差異很大，而且在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，馬鈴薯根際微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，這可能都與根系分泌物的組成和數(shù)量有關(guān)。擬南芥根系分泌物的組分與含量隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期不同而顯著變化，其根部相關(guān)基因的表達(dá)水平也相應(yīng)變化，且其根際微生物功能基因的表達(dá)模式與擬南芥不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的根系分泌物分泌模式顯著相關(guān)[6]。植物根系分泌物的產(chǎn)生是植物根部長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，是適應(yīng)環(huán)境的一種體現(xiàn)。本研究擬以湘苧3號(hào)、多倍體1號(hào)、中苧1號(hào)、湘苧7號(hào)和R057的土壤樣本基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用高通量測(cè)序方法初步探討苧麻根際微生物多樣性的特點(diǎn)，旨在為進(jìn)一步探索根系分泌物介導(dǎo)下苧麻-土壤-微生物的互作關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用苧麻種植于湖南省瀏陽(yáng)市澄潭江鎮(zhèn)“苧麻高產(chǎn)創(chuàng)建與高效施肥研究與示范基地”(北緯27°59′，東經(jīng)113°46′)，試驗(yàn)品種為湘苧3號(hào)、多倍體1號(hào)、中苧1號(hào)、湘苧7號(hào)和R057。 于2011年5月嫩梢扦插育苗，同年6月移栽，株距45 cm，栽培密度3.3×104株/公頃，同年8月破稈。2015年為5齡麻。土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of experiment soils

1.2 取樣方法

于2015年8月采用剝落法收集湘苧3號(hào)、多倍體1號(hào)、中苧1號(hào)、湘苧7號(hào)和R057 5個(gè)苧麻品種的根際土壤。首先選取生長(zhǎng)正常的植株，整蔸取出，抖落較松散的土壤，然后收集附著在根上0～4 mm間的土壤作為根際土[7]。將土壤樣品去除動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì)，裝入密封袋中，立即置于液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱中，備用。由于研究經(jīng)費(fèi)有限，本研究測(cè)序未設(shè)置生物學(xué)重復(fù)。

1.3 基因組DNA的提取

采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)對(duì)土壤樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.4 PCR擴(kuò)增

a.模板:稀釋后的基因組DNA；

b.引物:根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，引物設(shè)計(jì)如表2所示；

c.PCR 采用 rTaq DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系:10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μmol/L)0.8 μL，Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，補(bǔ)足 ddH2O 至 50 μL。 PCR 儀，ABI GeneAmp?9700 型。 16S rDNAPCR 擴(kuò)增條件:1×(3 minutes at 95 °C)；27×(30 seconds at 95 °C；30 seconds at 55 °C；45 seconds at72 °C)；10 minutes at 72 °C，10 °C until halted by user。 18S rDNA-PCR 擴(kuò)增條件:1×(3 minutes at 95 °C)；35×(30 seconds at 95 °C；30 seconds at 55 °C；45 seconds at 72 °C)；10 minutes at 72 °C，10°Cuntil halted by user。PCR產(chǎn)物采用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫。

表2 PCR引物設(shè)計(jì)Table 2 PCR primer design

1.5 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.6 Miseq文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

Miseq文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序在美吉生物(上海)科技有限公司進(jìn)行，測(cè)序平臺(tái)為 Illumina MiSeqPE300/PE250。

1.7 生物信息分析

測(cè)序結(jié)束后，對(duì)有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體等過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列。根據(jù)序列97%的相似性形成操作分類(lèi)單元OTU(Operational Taxonomic Units)，對(duì)OTU的代表序列作分類(lèi)學(xué)分析。基于OTU聚類(lèi)分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類(lèi)學(xué)信息，在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻根際土壤細(xì)菌群落多樣性分析

2.1.1 優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

湘苧3號(hào)、多倍體1號(hào)、中苧1號(hào)、湘苧7號(hào)和R057 5個(gè)品種土壤樣本中共得到180975個(gè)有效序列，總堿基數(shù)為79248780，平均序列長(zhǎng)度為437.86 bp。各樣本優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表3所示。

表3 各樣品優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Data statistics of each sample optimal sequence

2.1.2 苧麻根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

在97%相似水平上土壤樣品細(xì)菌群落多樣性指數(shù)如表4所示。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的生物分類(lèi)單元OTUs為754～950。Coverage(覆蓋率)是測(cè)序深度指數(shù)，其數(shù)值越高則表示樣本中序列被測(cè)出的概率越高，5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的覆蓋率均在99%以上，表明絕大部分的細(xì)菌種群都被檢測(cè)出來(lái)。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)是用來(lái)估算菌群豐度(Community richness)的指數(shù)，5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的Ace指數(shù)為817～999，Chao1指數(shù)為873～1012。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來(lái)估算菌群多樣性(Community diversity)的指數(shù)，Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低[10]。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的Shannon指數(shù)為5.39～5.94，Simpson指數(shù)為0.0049～0.0106。其中湘苧7號(hào)Shannon指數(shù)(5.39)低于其他4個(gè)樣品，而Simpson指數(shù)(0.0106)高于其他樣品并顯著高于湘苧3號(hào)，說(shuō)明湘苧7號(hào)品種細(xì)菌群落多樣性較其他品種為最低，湘苧3號(hào)品種細(xì)菌群落多樣性較其他品種為最高。

表4 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 4 Bacterial community diversity indices

2.1.3 苧麻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

苧麻根際土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上的組成和豐度如圖1所示。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品OTU與16S細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)(Silva、RDP、Greengene)比對(duì)[11-13]，歸屬于24門(mén)，52綱，125目，213科，329屬，569種。主要的門(mén)有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等。其中，變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)占主導(dǎo)地位，約占細(xì)菌總數(shù)的88.92%～97.45%。不同苧麻品種根際土壤中以Proteobacteria在細(xì)菌中所占比例最高，品種間變化范圍35.57%～50.08%；其次為Acidobacteria，品種間變化范圍17.53%～33.27%。

圖1 土壤細(xì)菌群落門(mén)分類(lèi)水平相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of soil bacterium on the level of phylum

2.2 苧麻根際土壤真菌群落多樣性分析

2.2.1 優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

湘苧3號(hào)、多倍體1號(hào)、中苧1號(hào)、湘苧7號(hào)和R057 5個(gè)品種土壤樣本中共得到143599個(gè)有效序列，總堿基數(shù)為59622314，平均序列長(zhǎng)度為400.98 bp。各樣本優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表5所示。

2.2.2 苧麻根際土壤真菌群落多樣性指數(shù)

在97%相似水平上土壤樣品真菌群落多樣性指數(shù)如表6所示。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的生物分類(lèi)單元OTUs為190～220。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的覆蓋率均在99%以上，表明絕大部分的真菌種群都被檢測(cè)出來(lái)。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品的Ace指數(shù)為200～232，Chao1指數(shù)為202～235，Shannon指數(shù)為2.63～3.43，Simpson指數(shù)為0.0671～0.2360。 其中湘苧3號(hào)的Shannon指數(shù)在5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品中最低，而Simpson指數(shù)顯著高于其他樣品。

表5 各樣品優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 5 Data statistics of each sample optimal sequence

表6 真菌群落多樣性指數(shù)Table 6 Fungus community diversity indices

2.2.3 苧麻根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

苧麻根際土壤樣品真菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上的組成和豐度如圖2所示。5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品OTU與ITS真菌數(shù)據(jù)庫(kù)(Unite)比對(duì)[14]，歸屬于43門(mén)，67綱，87目，102科，120屬，174種。主要的門(mén)有子囊菌門(mén)(Ascomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、纖毛亞門(mén)(Ciliophora)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)等，此外還檢測(cè)到有 Eukaryota_unclassified、Fungi_unclassified、扁形動(dòng)物門(mén)(Platyhelminthes)、芽枝霉門(mén)(Blastocladiomycota)、褐藻門(mén)(Ochrophyta)等。其中，以子囊菌門(mén)(Ascomycota)占據(jù)主導(dǎo)地位，占真菌總數(shù)的45.51%～68.96%；接合菌門(mén)(Zygomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)次之，分別占真菌總數(shù)的5.29%～15.81%和2.74%～20.13%。在5個(gè)苧麻品種中，湘苧3號(hào)根際土壤子囊菌門(mén)豐度最高(68.96%)，但接合菌門(mén)豐度最低(5.29%)；多倍體1號(hào)根際土壤子囊菌門(mén)豐度最低(45.51%)，但接合菌門(mén)豐度最高(15.81%)。

圖2 土壤真菌群落門(mén)分類(lèi)水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of soil fungus on the level of phylum

2.3 苧麻根際土壤真菌與細(xì)菌數(shù)量比值

苧麻根際土壤真菌與細(xì)菌數(shù)量比值通過(guò)樣品真菌OTUs數(shù)量與細(xì)菌OTUs數(shù)量比值來(lái)計(jì)算。有學(xué)者認(rèn)為，真菌型土壤是地力衰竭的標(biāo)志，細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的一個(gè)生物指標(biāo)[15]。不同苧麻品種根際土壤真菌與細(xì)菌數(shù)量比如圖3所示。由圖3可知，R057、多倍體1號(hào)、湘苧3號(hào)、湘苧7號(hào)和中苧1號(hào)根際土壤真菌與細(xì)菌數(shù)量比為0.23～0.29，其中以中苧1號(hào)根際土壤中真菌與細(xì)菌數(shù)量比最高。

圖3 土壤真菌與細(xì)菌數(shù)量比值Fig.3 Soil fungi and bacteria quantity proportion

3 討論與結(jié)論

高通量測(cè)序具有成本低、通量高等優(yōu)點(diǎn)，在微生物生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。本文通過(guò)Miseq測(cè)序平臺(tái)研究了苧麻根際土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成，以期為后續(xù)苧麻化感效應(yīng)研究奠定基礎(chǔ)。在本研究中，5個(gè)苧麻品種根際土壤樣品細(xì)菌和真菌的覆蓋率均在99%以上，表明絕大部分的細(xì)菌和真菌種群都被檢測(cè)出來(lái)，其中檢測(cè)到的主要細(xì)菌門(mén)有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等，真菌門(mén)主要有子囊菌門(mén)(Ascomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、纖毛亞門(mén)(Ciliophora)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)等。在本研究中細(xì)菌中以變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)門(mén)，真菌中子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)門(mén)。變形菌門(mén)在擬南芥、玉米、枸杞等根際中均有富集分布，可見(jiàn)變形細(xì)菌能夠適應(yīng)多種植物根際微環(huán)境[16-18]。酸桿菌門(mén)能夠降解復(fù)雜的木質(zhì)素和纖維素，殘留的苧麻植株經(jīng)過(guò)酸桿菌門(mén)的分解能夠?yàn)橥寥牢⑸锾峁┏渥愕哪茉?，并為土壤提供養(yǎng)分[19-21]。子囊菌和擔(dān)子菌是土壤中重要的分解者，子囊菌門(mén)大多數(shù)為腐生菌，可以分解木質(zhì)素、角質(zhì)素等難降解的有機(jī)質(zhì)，在養(yǎng)分循環(huán)中擔(dān)任著重要角色[22-24]。在本研究中，不同苧麻品種間微生物多樣性存在一定差異，且真菌的多樣性遠(yuǎn)低于細(xì)菌。朱四元等[25]研究表明，不同苧麻品種間根際微生物數(shù)量存在顯著差異，且細(xì)菌微生物量大于真菌；周建霞等[26]發(fā)現(xiàn)苧麻土壤微生物中細(xì)菌數(shù)量在品種間存在顯著差異；方敏等[27]研究表明，馬纓杜鵑根系微生物分布于41個(gè)細(xì)菌門(mén)和6個(gè)真菌門(mén)，且根系不同生態(tài)位之間微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，根系分泌物影響著土壤中養(yǎng)分的有效性、重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、根際土壤的理化性質(zhì)以及根際微生物種群的結(jié)構(gòu)[28]。在作物種植生產(chǎn)中，一些作物的根系分泌物能夠刺激某些有害根際微生物的生長(zhǎng)和繁殖，這些有害微生物對(duì)下茬同一作物的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用，造成連作障礙[29]。植物分泌的化感物質(zhì)和根際微生物之間的相互作用是一個(gè)重要過(guò)程，植物根系分泌的各種次生代謝產(chǎn)物對(duì)根際微生物的種類(lèi)、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響[30]。白玉超等[31-32]以甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯和正己烷為浸提劑，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)苧麻根際分泌物進(jìn)行了組分分析，主要鑒定出2，4-二叔丁基苯酚、棕櫚酸、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、十八碳酸甲酯等物質(zhì)。酚酸類(lèi)物質(zhì)是一種重要的化感物質(zhì)，能抑制微生物產(chǎn)生氣體與揮發(fā)性脂肪酸的作用，并能減少微生物對(duì)其生長(zhǎng)介質(zhì)的消耗，同時(shí)，微生物的分布類(lèi)群與土壤中酚酸的種類(lèi)和濃度也存在一定的關(guān)系[33-34]。有研究[35]指出，隨著大棚番茄連作年限的增加，番茄根分泌的酚酸類(lèi)物質(zhì)增加了土壤中有害真菌的數(shù)量。苧麻作為多年生作物，其根系分泌物與根際微生物多樣性的關(guān)系尚不明確。苧麻根際土壤中積累的化學(xué)物質(zhì)可能直接影響根系生長(zhǎng)或通過(guò)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)而改變土壤環(huán)境，進(jìn)而影響苧麻的生長(zhǎng)，這可能是探索苧麻敗蔸機(jī)理研究中的一個(gè)重要方向。