韓翠翠 劉立琨 王玉春 楊瑩 劉吉成 周忠光

（1. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040；3. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院，齊齊哈爾 161006）

TOX高遷移率蛋白盒家族成員（TOX highmobility box protein group family member3，TOX3）基因為高遷移率蛋白（High mobility group，HMG）家族成員之一。2007年，Easton等［1］通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)其與乳腺癌易感性相關(guān)。隨后，在不同人群的GWAS研究中進一步證實了TOX3與乳腺癌的發(fā)展存在強烈的相關(guān)性［2-14］。研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌組織中通常過表達，而在正常乳腺組織中低表達或表達缺失［15］，且與臨床TNM分期分級密切相關(guān)，與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在相關(guān)性［16］。但其在乳腺癌惡性病變進程中所發(fā)揮的具體生物學(xué)功能尚不明確。因此，構(gòu)建穩(wěn)定沉默TOX3基因的乳腺癌細胞模型對于深入研究其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制則尤為重要。

本研究擬構(gòu)建TOX3 RNAi慢病毒表達載體，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，采用實時熒光定量PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ZR-75-1細胞內(nèi)TOX3 mRNA及蛋白表達水平，構(gòu)建穩(wěn)定沉默TOX3基因的乳腺癌細胞模型，并初步探討干擾TOX3基因的表達對乳腺癌細胞增殖的影響，旨為進一步深入研究TOX3基因在乳腺癌發(fā)展進程中的生物學(xué)功能奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌ZR-75-1細胞、人腎上皮293T 細胞均購于中科院上海細胞庫；胎牛血清、1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；慢病毒載體質(zhì)粒、包 裝 質(zhì) 粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G） 及 RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑均購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；DNA內(nèi)切酶（BamHI、EcoRI）和T4 DNA連接酶購自MBI Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司；嘌呤霉素購自美國Sigma公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，兔抗人TOX3單克隆抗體購自Abcam公司；抗兔二抗購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向TOX3基因shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建 GenBank 搜索TOX3基因序列（NM_00108043-0.2），依據(jù)shRNA序列設(shè)計原則，設(shè)計合成3條干擾靶序列及1條陰性對照序列。退火合成雙鏈DNA，T4 DNA連接酶連接線性化LV3-shRNA載體；制備感受態(tài)細胞DH5α；挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒后進行測序鑒定。靶向TOX3基因干擾序列，如表1所示。

表1 針對TOX3基因的3個干擾靶序列

1.2.2 慢病毒包裝 將293T細胞培養(yǎng)于含有10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待其生長到80%左右融合時，將空質(zhì)粒pGLV3/H1/GFP-Puro、重組質(zhì)粒pGLV3/H1/GFPPuro-shTOX3、和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G按比例加入裝有1.5 mL無血清培養(yǎng)基的離心管中，混勻。另將轉(zhuǎn)染試劑RNAi-Mate加入裝有1.5 mL無血清的培養(yǎng)基中，混勻。室溫放置5 min后，將兩管試劑混勻。室溫放置20-25 min后，去除培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液，加入新的無血清培養(yǎng)液，將混合液加入細胞培養(yǎng)液中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6 h。除去轉(zhuǎn)染液，加入含血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。吸取細胞上清液到離心管中，低速離心，0.45 μm過濾，在4℃ 20 000 r/min條件下超速離心2 h，收集濃縮液。

1.2.3 病毒滴度檢測 在檢測病毒滴度前1 d，以3×104個/孔的細胞密度將293T細胞接種于96孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用含有10%FBS的培養(yǎng)基將10 μL慢病毒原液10倍稀釋4個梯度。吸棄96孔板內(nèi)的舊培養(yǎng)液，加入稀釋好的病毒液，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將病毒液吸出，每孔加入完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。于熒光顯微鏡下計數(shù)表達綠色熒光細胞的數(shù)目。并結(jié)合相應(yīng)的稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.2.4 轉(zhuǎn)染ZR-75-1細胞并建立穩(wěn)定的細胞系 取生長狀態(tài)良好的ZR-75-1細胞，以5×104個細胞/孔的細胞密度接種于24孔板內(nèi)，加入500 μL完全培養(yǎng)基，過夜。將慢病毒液按照預(yù)實驗得到的合適的感染參數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）加入到含有聚凝胺的400 μL培養(yǎng)基中，使聚凝胺的終濃度為5 μg/mL。同時設(shè)立空白對照組（未轉(zhuǎn)染的ZR-75-1細胞）、陰性對照LV3-NC組（轉(zhuǎn)染空載體）、TOX3-shRNA-1組、TOX3-shRNA-2組和TOX3-shRNA-3組。12 h后棄掉含有病毒液的培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄掉舊培養(yǎng)基，加入含有嘌呤霉素2 μg/mL的篩選培養(yǎng)基（經(jīng)預(yù)實驗確定ZR-75-1細胞的最小死亡濃度為2 μg/mL），每2-3 d更換篩選培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)7 d，隨后更換為濃度為1 μg/mL的篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。獲得具有抗性的轉(zhuǎn)染細胞，熒光顯微鏡下觀察表達GFP細胞的比例。篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的抗性陽性克隆，擴大培養(yǎng)。所建立的細胞分別命名為TOX3-shRNA-1、TOX3-shRNA-2、TOX3-shRNA-3和LV3-NC。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測ZR-75-1細胞TOX3mRNA的表達 應(yīng)用Trizol提取各組細胞總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實時熒光定量PCR儀檢測TOX3 mRNA的表達。PCR反應(yīng)引物如下：β-actin：上游引物 ：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′；TOX3：上游引物 ：5′-TATGCCTCACACATCTCCTTCA-3′，下游引物 ：5′-ATGGCTCTGTTGGCTTCATC-3′。PCR 反應(yīng)條件為第一步：95℃ 30 s，1個循環(huán)；第二步：變性：95℃ 5 s；退火：60℃ 31 s，40個循環(huán)。

1.2.6 Western blot檢測ZR-75-1細胞TOX3蛋白的表達 收集各組細胞，應(yīng)用RIPA強效裂解液提取各組細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度并定量。取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，采用BSA封閉液4℃封閉過夜。加入兔抗人TOX3單克隆抗體（1∶2 000），小鼠抗人GAPDH多克隆抗體（1∶3 000），室溫孵育3 h，TBST洗膜，HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶3 000），馬抗小鼠二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，曝光。

1.2.7 MTT法檢測TOX3對細胞增殖能力的影響 將各組細胞以3×103個/孔細胞密度接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日棄掉舊培養(yǎng)基，每孔加入200 μL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。于檢測當(dāng)日加入20 μL MTT溶液，37℃孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫震蕩使結(jié)晶充分溶解。于570 nm波長處，應(yīng)用酶標儀檢測各孔吸光度值。以時間為橫坐標，測得的吸光度值為縱坐標，繪制第0天至第7天各組細胞的生長曲線。

1.2.8 平板單克隆形成實驗 將各組細胞接種于6孔板內(nèi)，使細胞密度為3 000個/孔。視細胞生長情況每3-4 d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，除去舊培養(yǎng)基，PBS清洗。加入冰甲醇固定10 min。再用PBS洗2次。加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗去結(jié)晶紫。計細胞數(shù)大于50個的集落數(shù)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，計算集落形成率。集落形成率（%）=計數(shù)細胞集落數(shù)/細胞總數(shù)集×100%。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒的測序鑒定

抽提3組重組載體質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定結(jié)果（圖1）顯示，各組質(zhì)粒序列正確。

2.2 慢病毒表達載體的包裝及滴度檢測

病毒滴度檢測結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)病毒包裝重組質(zhì)粒 TOX3-shRNA-1，TOX3-shRNA-2，TOX3-shRNA-3的病毒滴度分別為3×108TU/mL，4×108TU/mL和2×108TU/mL。

2.3 轉(zhuǎn)染效率的測定

經(jīng)嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察表達GFP的細胞比例。結(jié)果（圖3）顯示LV3-NC組、TOX3-shRNA-1組、TOX3-shRNA-2組 和TOX3-shRNA-3組GFP表達均約達到95%以上。

2.4 轉(zhuǎn)染后ZR-75-1細胞中TOX3 mRNA的表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖4）顯示，與空白對照組比較，空載體LV3-NC組TOX3 mRNA的相對表達無明顯差異（P＞0.05），而與空載體LV3-NC對照組比較，不同的TOX3-shRNA干擾序列均顯示出明顯的干擾效果（P＜0.05），其中TOX3-shRNA-3組的mRNA表達水平最低，干擾效率最高。

圖1 TOX3-shRNA干擾質(zhì)粒測序圖譜

圖2 重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞后GFP的表達（×40）

圖3 經(jīng)嘌呤霉素篩選后ZR-75-1細胞的GFP表達（×40）

2.5 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ZR-75-1細胞TOX3蛋白的表達

蛋白檢測結(jié)果（圖5）顯示，與空白對照組比較，空載體LV3-NC組TOX3蛋白的相對表達無明顯差異（P＞0.05）。與空載體LV3-NC對照組比較，不同干擾序列TOX3蛋白的表達水平均明顯降低（P＜0.05），其中 TOX3-shRNA-3組 TOX3蛋白水平最低，與實時熒光定量PCR結(jié)果一致。因此，在后續(xù)實驗中我們選取TOX3-shRNA-3組細胞作為研究TOX3基因?qū)θ橄侔┘毎鲋郴钚杂绊懙募毎Ｐ汀?/p>

圖4 轉(zhuǎn)染ZR-75-1細胞后TOX3 mRNA的相對表達

圖5 轉(zhuǎn)染后各組細胞TOX3蛋白的相對表達

圖6 干擾TOX3基因?qū)R-75-1細胞增殖的影響

圖7 干擾TOX3對ZR-75-1細胞單克隆形成的影響

2.6 干擾TOX3基因?qū)R-75-1細胞增殖的影響

穩(wěn)定干擾TOX3基因的表達后，采用MTT實驗觀察0-7 d干擾TOX3基因?qū)R-75-1細胞增殖的影響。實驗結(jié)果（圖6）顯示：與空白對照組比較，陰性對照組細胞增殖活性沒有顯著變化。與陰性對照組比較，隨著時間的推移TOX3-shRNA-3組細胞的增殖能力明顯下降。平板單克隆實驗結(jié)果（圖7）顯示，與陰性對照組比較，干擾TOX3基因后，細胞的集落形成率明顯降低，單克隆形成能力減弱。

3 討論

乳腺癌疾病已成為女性死亡的重要原因，目前尚未完全闡明其發(fā)病機制。研究認為其惡性表征相關(guān)基因的異?？赡転槠浒l(fā)病機制之一。TOX3屬于HMG家族成員之一，此家族蛋白在調(diào)控基因表達及細胞增殖分化等方面均起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)TOX3與乳腺癌易感性相關(guān)［1］。隨后，在不同人群的GWAS研究也中進一步證實了TOX3與乳腺癌的危險性存在強烈相關(guān)性［2-14］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，與ER陰性乳腺癌相比，位于TOX3基因上的多態(tài)性位點與ER陽性乳腺癌具有更強的相關(guān)性［4，15］。在ER陽性，HER2陰性乳腺癌患者中，TOX3基因的rs3803662多態(tài)性位點可作為絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女乳腺癌患病風(fēng)險的預(yù)測因子之一［16］，但TOX3基因在乳腺癌發(fā)展中的作用機制尚不清楚，相關(guān)文獻報道也較少。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中TOX3蛋白的表達量明顯高于正常組織，且其表達水平與臨床TNM分期和分級具有明顯相關(guān)性［17］，在生存期較短的乳腺癌患者中，TOX3的mRNA表達水平較高，且其表達水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)［18］。此外，Smid等［19］研究發(fā)現(xiàn)TNRC9（TOX3）基因在乳腺癌患者骨中高表達，認為TOX3可能是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。研究進一步發(fā)現(xiàn)過表達TOX3基因可促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并可通過下調(diào)BRCA1的表達增強乳腺癌細胞侵襲能力；干擾TOX3基因后，成瘤率明顯降低，且形成的腫瘤也明顯減小［20］。因此，TOX3在乳腺癌的發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用，對乳腺癌的發(fā)展可能是一個危險因素。

RNA干擾是近年用于研究特定基因功能的常用技術(shù)，其可精確沉默或敲除特定基因，對基因的抑制作用強且特異性高，為基因的功能學(xué)研究提供了有效的研究方法［21］。RNA干擾常用的表達載體主要有慢病毒、腺病毒和質(zhì)粒，其中慢病毒載體能夠?qū)⒛康幕蚋咝У恼系剿拗骷毎幕蚪M內(nèi)，使目的基因在傳代的過程中仍可長期穩(wěn)定表達，其應(yīng)用范圍較廣，轉(zhuǎn)染效率高，不產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)染等方法引起的細胞損傷反應(yīng)，是目前進行基因功能研究和基因治療的有力工具。研究者應(yīng)用慢病毒表達載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達TOX3基因的乳腺癌MDA-MB-231細胞系，結(jié)果表達GFP細胞的數(shù)目達95%以上，且轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞內(nèi)TOX3的表達明顯升高［22］。在RNAi實驗中，能否抑制目的基因的表達，靶序列的設(shè)計非常重要。研究者通過設(shè)計合成3條FUT8基因的shRNA干擾靶序列，經(jīng)退火，線性化連接，構(gòu)建FUT8基因的RNAi慢病毒表達載體，并將其轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細胞中，轉(zhuǎn)染效率達90%，各干擾組FUT8 mRNA和蛋白的表達均明顯降低，其中pGC-shFUT8-2 序列的干擾效率最高，且發(fā)現(xiàn)干擾FUT8基因后，MCF-7細胞增殖能力下降［23］。在本研究中，根據(jù)GeneBank中提供的TOX3基因序列，針對基因不同位點，按照設(shè)計原則設(shè)計合成3條shRNA靶序列，并將其連接到LV3-shRNA中，進行重組克隆，經(jīng)測序驗證，序列正確，成功構(gòu)建了shRNA表達載體。我們將構(gòu)建好的TOX3-shRNA表達載體，經(jīng)病毒包裝，采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染自身高表達TOX3基因的人乳腺癌細胞系ZR-75-1，通過嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)目可達95%以上，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TOX3基因的細胞系ZR-75-1。通過實時熒光定量PCR和Western blot進一步驗證干擾效果，篩選出干擾效果最好的靶序列TOX3-shRNA-3，成功獲得了穩(wěn)定沉默TOX3基因的乳腺癌細胞系ZR-75-1，并將其確定為后續(xù)實驗研究細胞模型。MTT實驗和平板克隆實驗初步探討干擾TOX3基因的表達對乳腺癌細胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)干擾TOX3可使ZR-75-1細胞的增殖能力下降，單克隆形成能力減弱，而TOX3基因的其他生物學(xué)功能及調(diào)控機制仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建TOX3基因的RNAi慢病毒載體，并獲得穩(wěn)定沉默TOX3基因的乳腺癌ZR-75-1細胞系，初步發(fā)現(xiàn)沉默TOX3后ZR-75-1細胞的增殖能力下降。