鄭海亮 王東方 方雅 刁小偉 文勇，2 袁云霞，2

（1. 江蘇奧賽康生物醫(yī)藥有限公司，南京 211112；2. 江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，南京 211112）

核因子 -κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）是由Sen和Baltimor首次從B淋巴細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白因子，能夠與免疫球蛋白κ輕鏈的κB序列相結(jié)合［1］。NF-κB蛋白家族包括5個亞基：NF-κB1（P50）、NF-κB2（P52）、RelA（P65）、Rel（c-REL）和RelB，這些亞基能夠形成同源或異源二聚體存在于細胞質(zhì)中，其中以P50-P60形式最為常見。這些二聚體通常與抑制因子IκB（Inhibitor of NF-κB）結(jié)合，形成復(fù)合物，處于非激活狀態(tài)。當(dāng)受到刺激因素如腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 病 毒、 氧 自 由 基、 脂 多 糖（Lipopolysaccharides，LPS）等刺激時，復(fù)合物被激活，解離出NF-κB并轉(zhuǎn)移至細胞核中與相應(yīng)的位點結(jié)合啟動基因轉(zhuǎn)錄［2］。此外，NF-κB參與成纖維細胞生長因子受體（Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）［3］、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）［3］、神經(jīng)生長因子受體（Nerve growth factor receptor，NGFR）［4］、 白 介 素 -1 受 體（Interleukin-1 receptor，IL-1R）［5-6］、CD40［7］等 受體或受體家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是眾多信號通路的交匯點，能夠與多種細胞因子基因的啟動子或增強子相結(jié)合，參與調(diào)控細胞增殖、分化、炎癥和凋亡等過程。

報告基因（Reporter gene）是指編碼易于被檢測的酶或蛋白的基因，通常插入到表達調(diào)節(jié)序列當(dāng)中，或與目的基因相連接形成嵌合序列。由于報告基因法作用迅速，往往只需要幾個小時即可獲取到檢測結(jié)果，在體外藥物篩選中可實現(xiàn)高通量操作，因此備受關(guān)注［8］。常用的報告基因包括熒光素酶（Luciferase）、熒光蛋白和β-半乳糖苷酶等。熒光素酶是指來源于自然界能夠發(fā)光的生物體內(nèi)，可以催化熒光素氧化發(fā)光的一類酶的總稱，具有非放射性、靈敏度高、反應(yīng)迅速、半衰期長等優(yōu)點。截至目前，應(yīng)用最為廣泛的是來自于螢火蟲和發(fā)光海腎的熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是一個單亞基蛋白，穩(wěn)定性好且不需要進行翻譯后修飾，可用于報告基因系統(tǒng)［9］。

在本研究中，構(gòu)建了NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆細胞系，由于NF-κB涉及細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此可用于NF-κB激活相關(guān)的藥物活性檢測，可進行改造和應(yīng)用。本研究中以FGFRⅡ為例，對其擴展應(yīng)用進行了初步驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

Plentivirus-NF-κB-RE-Luc2P， 購 買 于 QIAGEN公司；Plentivirus-FGFRⅡ，購買于Cyagen公司；HEK293細胞，購買于中科院細胞庫；TNF-α，購自R&D公 司；生 長 培 養(yǎng) 基，DMEM（GIBCO）+10%FBS（GIBCO）+1%青鏈雙抗（GIBCO），工作培養(yǎng)基，DMEM+1%FBS；選擇培養(yǎng)基：生長培養(yǎng)基+2 μg/mL Puromycin（GIBCO），生長培養(yǎng)基 +2 μg/mL Puromycin+300μg/ml Hygromycin（GIBCO）；SURE-entry，熒光素酶顯色劑（One-Glo），購自 Promega公司；RNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBRGREEN I matrix，購自Takara公司；Palifermin?購自Amgen公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細胞培養(yǎng) 病毒感染前1 d，采用0.25%胰酶消化，將處于對數(shù)生長期的細胞制備成單細胞懸液并計數(shù)，以1.6×104/mL細胞濃度接種24孔培養(yǎng)板，細胞數(shù)目為8×104/孔，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.2.2 病毒感染HEK293細胞 根據(jù)病毒感染使用說明，取一支病毒懸液于4℃ 解凍。移除24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，依次緩慢加入相應(yīng)體積10%FBS+DMEM 培養(yǎng)基，完全解凍的病毒懸液，感染輔助試劑SURE-entry（終濃度=8 μg/mL），輕輕搖勻，37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中放置6-8 h，鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好，繼續(xù)培養(yǎng)72-96 h。

1.2.3 加壓篩選及單克隆細胞株分離培養(yǎng) 培養(yǎng)72-96 h后，更換為選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，間隔每2-3 d換液，篩選時間約2-3周，細胞融合度達到約90%時擴大培養(yǎng)至75 cm2細胞瓶，凍存多克隆細胞系。多克隆細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后進行單克隆篩選，以5/mL細胞濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)目為0.5個，24 h后鏡下觀察，挑選只含有單個細胞的細胞孔，間隔3-4 d換液，篩選時間約3周，細胞融合度達到約90%時消化細胞并逐漸擴大培養(yǎng)至75 cm2細胞瓶，凍存單克隆細胞系。

1.2.4 RT-QPCR 取 1×106個 FGFR Ⅱ /NF-κB-RELuc2P HEK293細胞提取RNA并測定RNA濃度。RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，反應(yīng)體系為 1 μg RNA，4 μL 5× prime script buffer，1 μL Oligo DT primer，1 μL Oligo DT primer Random 6mers，補 H2O 至 20 μL。QPCR 反 應(yīng) 體 系 為 12.5 μL SYBRGREEN I matrix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，5 μL cDNA，補H2O至25 μL。引物序列：目的基因FGFRⅡ-F/R，CTCAAGCACTCGGGGATAAA/ CTGTTTTGGCAGGA-CAGTGA；內(nèi)參基因Beta-actin-F/R，CATCGAGCACGGCATCGTCA/ TAGCACAGCCTGGATAGCAAC。反應(yīng)程序為 95℃，15 s，40個循環(huán)；60℃，15 s，70℃，10 s。2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

1.2.5 細胞系熒光素酶活性檢測 取對數(shù)生長期的 NF-κB-RE-Luc2P HEK293 或 FGFR Ⅱ /NF-κB-RELuc2P HEK293細胞，消化計數(shù)，用工作培養(yǎng)基1%FBS+DMEM 稀釋至 4×105個 /mL，轉(zhuǎn)移 100 μL到96孔板中，細胞數(shù)目4×104個/孔，過夜培養(yǎng)。TNF-α刺激 NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞，生長培養(yǎng)基2倍梯度稀釋TNF-α（100 ng/mL，共12個濃度梯度，每孔100 μL加入96孔板中；FGF融合蛋白刺激FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞，工作培養(yǎng)基4倍梯度稀釋FGF融合蛋白（50 ng/mL），共10個濃度梯度，每孔100 μL加入96孔板中；37℃、5%CO2孵育6 h后，每孔加入One-Glo 50 μL，室溫反應(yīng)5 min，放入酶標儀讀數(shù)，實驗結(jié)果采用四參數(shù)擬合。

1.2.6 統(tǒng)計分析 每組實驗均重復(fù)3次或3次以上，所獲得的數(shù)據(jù)均以平均值±標準差形式進行表示，數(shù)據(jù)均采用Graph-pad Prism5軟件進行分析，不同數(shù)據(jù)間對比采用t檢驗法，當(dāng)P＜0.05時差異顯著（*），當(dāng)P＜0.01時差異極顯著（**表示P＜0.01，***表示P＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 病毒最佳感染效率（MOI）確定

在NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染HEK293實驗中，MOI分別設(shè)置了0、5、10、15和20等5個梯度，實驗結(jié)果（圖1-A）表明，MOI為10-20時轉(zhuǎn)染效果較好，其中又以MOI=15轉(zhuǎn)染效率最高。當(dāng)MOI=15時，用NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染細胞，所獲得的多克隆細胞接種于96孔板中，進行功能驗證。加入20 ng/mL TNF-α刺激6 h后，采用One-Glo化學(xué)發(fā)光法進行檢測，信噪比可達到20.2倍（P=0.007 3）（圖 1-B），結(jié)果表明 NF-κB-RE-Luc2P慢病毒已成功感染HEK293細胞。

2.2 NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞系單克隆篩選及驗證

為了進一步得到穩(wěn)定傳代的細胞系，多克隆細胞NF-κB-RE-Luc2P HEK293采用有限稀釋法進行單克隆分離培養(yǎng)，使用Puromycin加壓篩選。經(jīng)過加壓與分離培養(yǎng)，成功地獲得了NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆穩(wěn)定表達細胞系。將獲取的單克隆細胞鋪到96孔板，進行功能驗證。TNF-α（100 ng/mL起始，2倍梯度稀釋）刺激6 h，采用One-Glo化學(xué)發(fā)光法進行檢測。數(shù)據(jù)顯示（圖2-A），響應(yīng)值與TNF-α濃度可擬合成劑量依賴的“S”型曲線，當(dāng)TNF-α濃度為20 ng/mL時與對照組相比，信噪比可達到113.7倍以上（P＜0.001）（圖2-B）。結(jié)果表明，本研究成功獲得NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆細胞系。

圖1 MOI及病毒感染驗證

2.3 NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞系應(yīng)用實例

為了證明NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆細胞系改造后可用于藥物活性檢測，將此細胞系感染FGFRⅡ受體，按照同樣的單克隆篩選流程，使用Puromycin和Hygromycin加壓培養(yǎng)，獲得單克隆細胞 FGFR Ⅱ /NF-κB-RE-Luc2P HEK293。RT-QPCR檢測FGFRⅡ mRNA表達水平，其表達水平顯著高于對照組細胞，比值可達到204倍（204.2∶1）（圖3-A），結(jié)果表明，F(xiàn)GFRⅡ成功導(dǎo)入到NF-κB-RELuc2P HEK293，并可穩(wěn)定表達。

為了進步驗證此細胞系的藥物檢測功能，選用FGF7類蛋白藥物Palifermin?，梯度稀釋后加入到此細胞系中，結(jié)果（圖3-B）顯示，響應(yīng)值與Palifermin?濃度呈劑量依賴型S曲線，表明該細胞系可用于FGF7蛋白藥物活性檢測。

圖2 NF-κB-RE-luc2P HEK293細胞系TNF-α刺激實驗

圖3 FGFR II/NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞系鑒定

3 討論

隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展與檢測手段的不斷革新，熒光素酶報告基因法憑借其靈敏度高、簡便可靠等技術(shù)優(yōu)點越來越受業(yè)內(nèi)關(guān)注，已逐漸成為藥物篩選及體外活性檢測的發(fā)展趨勢。然而，針對不同生物靶點的藥物篩選及藥物活性檢測，往往需要對其適配的工程細胞系進行單獨構(gòu)建或定制，人力、物力及時間成本投入較大。因此，在一定程度上具備通用性的細胞系就顯得尤為必要。

NF-κB信號通路與機體免疫、炎癥反應(yīng)和細胞生長及分化緊密相關(guān)，以NF-κB及其信號通路為靶標的藥物可用于腫瘤和炎癥的預(yù)防與治療。如NF-κB特異性抑制劑藥物（Dehydroxymethylepoxyquinomicin，DHMEQ），在肺癌［10］、肝癌［11］、乳腺癌［12］和多發(fā)性骨髓瘤［13］的體內(nèi)外研究中均取得了理想的研究結(jié)果，又如地塞米松、阿司匹林和舒林酸等抗炎藥物，也是通過阻斷NF-κB通路發(fā)揮其抗炎效果［14］。除此之外，NF-κB還廣泛參與TNFR、FGFR、EGFR、NGFR、IL-1R和CD40等受體或受體家族的調(diào)節(jié)過程，是眾多信號通路的交匯點［15-16］，因此該細胞系在這類靶點相關(guān)藥物的篩選及檢測中，具備通用性。

細胞系構(gòu)建及篩選是一個復(fù)雜而又繁瑣的實驗過程。在本研究中，以慢病毒為載體，攜帶目的基因進行感染HEK293，由于病毒感染的過程對細胞具有一定損傷作用，因此實驗時必須保證HEK293維持在較好的細胞狀態(tài)，如待用培養(yǎng)基必須37℃預(yù)熱、病毒及SURE-entry的添加必須輕柔避免細胞脫落等。在單克隆篩選實驗中，本研究采用的是有限稀釋法進行分離培養(yǎng)，因此在克隆挑選時必須在細胞發(fā)生分裂前進行，此時細胞孔內(nèi)僅有單個細胞，從而可以保證所獲得的細胞系均為單一克隆。

在本研究中，以NF-κB-RE-Luc2P慢病毒為載體，經(jīng)感染、抗生素加壓與單克隆分離培養(yǎng)成功獲得了NF-κB-RE-Luc2P單克隆細胞系，該細胞系可直接用于以TNF-α或其受體家族為靶點的藥物篩選及活性檢測，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶向治療藥物Humira?及其生物類似藥等［17］。同時本研究還奠定了以NF-κBRE-Luc2P HEK293細胞系為基礎(chǔ)，針對不同的研究需求繼續(xù)進行改造和完善的方案，繼續(xù)引入EGFR、FGFR、NGFR等受體，可用于后續(xù)的相關(guān)藥物活性檢測。如本研究成功導(dǎo)入了受體FGFRⅡ，獲得了FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞系，進行了體外FGF類藥物驗證實驗，結(jié)果表明該細胞系可用于FGF類藥物的活性檢測。

4 結(jié)論

在本研究中，采用慢病毒感染方法成功構(gòu)建了NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞系，該細胞系可直接用于以TNF-α或其受體家族為靶點的藥物篩選及活性檢測。同時，由于NF-κB還涉及EGFR、FGFR、NGFR、IL-1R和CD40等受體或受體家族介導(dǎo)的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以此細胞系為基礎(chǔ)感染FGFR家族的受體FGFRⅡ，并進行了初步確證，結(jié)果表明響應(yīng)值與藥物Palifermin?呈現(xiàn)濃度依賴型“S”型曲線，可用于該類藥物活性檢測。綜上所述，本研究成功獲得了穩(wěn)定表達的NF-κB-RE-Luc2P HEK293細胞系。由于NF-κB是細胞內(nèi)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點，因此該細胞系具備通用性及進一步改造的潛力，具有研究及應(yīng)用價值。