侯成林 楊艷坤 陳嘉荔 白仲虎

（江南大學生物技術(shù)學院 碳水化合物與生物技術(shù)教育部重點實驗室 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室 谷物發(fā)酵技術(shù)國家工程實驗室，無錫 214122）

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）是甲醇酵母。甲醇為單一碳源時，P. pastoris胞內(nèi)的醇氧化酶 1（Alcohol oxidase 1，Aox1，EC1.1.3.13）能高效催化甲醇氧化成甲醛，同時 Aox1可達到細胞干重的30%［1-2］。利用高效的Aox1啟動子（aox1promoter，Paox1）啟動外源蛋白的表達，成功構(gòu)建了巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的重組蛋白表達系統(tǒng)之一［3-4］。然而P.pastoris甲醇的代謝存在碳源阻遏現(xiàn)象，即葡萄糖、甘油等碳源的存在可以阻遏甲醇的代謝，Paox1在甲醇為唯一碳源時被激活，在甘油存在時被抑制［5］。甘油代謝和甲醇代謝之間調(diào)控的分子機理尚不十分清晰，Paox1的激活和抑制是其研究的核心。

目前已發(fā)現(xiàn)多個調(diào)控Paox1的轉(zhuǎn)錄因子［6-7］，其中甲醇表達調(diào)控因子1（Methanol expression regμLator 1，Mxr1，GenBank：ABD57365.1）是最重要的Paox1激活因子，Mxr1的缺失會導致P. pastoris無法利用甲醇［8-9］。研究表明，Mxr1是組成型表達，但是，在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄激活活性；在甘油培養(yǎng)基無活性［3，10］。同時發(fā)現(xiàn)Mxr1上存在磷酸化的Ser215位點，能夠調(diào)控Mxr1轉(zhuǎn)錄激活活性［8］。說明Mxr1功能的發(fā)揮主要受磷酸化修飾調(diào)節(jié)。但是對Mxr1去磷酸化的酶一直尚未發(fā)現(xiàn)，本文在研究與Mxr1相互作用的蛋白中找到了使Mxr1去磷酸化的酶—蛋白質(zhì)磷酸酪氨酸磷酸酶（Protein phosphotyrosine phosphatase，Ptp），并發(fā)現(xiàn)該酶對Mxr1的磷酸化水平的調(diào)節(jié)有明顯的調(diào)控效果。蛋白質(zhì)磷酸酪氨酸磷酸酶是一種比較保守的低分子量的磷酸酶［11-12］，而蛋白的磷酸化和去磷酸化對蛋白活性的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用［13］，推測蛋白質(zhì)磷酸酪氨酸磷酸酶調(diào)控Mxr1磷酸化，進而調(diào)控Mxr1活性。

1 材料和方法

1.1 材料

LA Taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶（EcoRI、XhoI、SacI）、T4 DNA 連接酶、卡那霉素、博來霉素、四環(huán)素，分光光度計（上海美諾達儀器有限公司），凝膠成像儀，蛋白質(zhì)電泳儀（北京六一儀器），PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司）。

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 巴斯德畢赤酵母（P. pastoris）GS115、pGAPZB畢赤酵母表達載體、大腸桿菌E.coliDH5α，E. coliBL21，pSVT7大腸桿菌表達載體（表 1）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、1×105Pa 滅菌20 min，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉）、LLB培養(yǎng)基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、1×105Pa滅菌20 min，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉）、BMY培養(yǎng)基（酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、100mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.1，1×105Pa滅菌20 min，無菌酵母無氨基酸氮源YNB 13.4 g/L，無菌生物素0.4 mg/L，碳源按照實驗要求后續(xù)添加）、YPD培養(yǎng)基（酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、115℃滅菌30 min，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉）。TB/SB培養(yǎng)基酵母提取物13 g/L、胰蛋白胨 24 g/L、 甘 油 10 g/L、KH2PO423.1 g/L、K2HPO412.55 g/L，1×105Pa滅菌 20 min。

表1 實驗所用菌株及表型

1.1.3 引物 本研究所用到的引物（表2）由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 磷酸酶Ptp高表達載體的構(gòu)建及宿主轉(zhuǎn)化 以GS115基因組為模板，PCR擴增ptp片段，純化，用KpnI，NotI分別雙酶切片段和pGAPZB質(zhì)粒，分化純化回收，用T4連接酶鏈接片段和載體，得到ptp高表達載體PGAP-PTP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，然后用含有博來霉素的LLB平板篩選和PCR菌落鑒定，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，保存測序正確的菌株。挑選重組子單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，提取基因組，用引物zecin-f，zecin-r擴增博來霉素基因。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PGAP-PTP在P.pastoris染色體的整合情況。篩選到的重組子命名為PTP-GS115。

1.2.2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除磷酸酶ptp及構(gòu)建Mxr1S215A定點突變菌株 利用本實驗室構(gòu)建好的基因編輯系統(tǒng)，設(shè)計3條sgRNA，電轉(zhuǎn)cas9-GS115感受態(tài)，經(jīng)過PCR，測序驗證，在48堿基處成功敲除1個堿基，命名為ΔPTP-GS115。構(gòu)建定點突變的上下游500 bp同源臂，通過融合PCR，形成上游同源臂定點突變下游同源臂序列，在突變位點上下200 bp左右設(shè)計3條sgRNA，構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)Cas9-GS115通過PCR驗證敲掉的堿基數(shù)和定點突變。培養(yǎng)P.pastoris細胞、提取基因組及總蛋白質(zhì)參照Invitrogen公司操作手冊。

表2 實驗所用的引物及sgRNA序列

1.2.3 熒光定量PCR檢測Mxr1不同突變體下游基因表達量 將保存于YPD平板的突變菌株GS115和野生型GS115接種于YPD液體培養(yǎng)基進行過夜活化，統(tǒng)一OD600=0.5用無菌PBS洗3次，接種與含有1%甲醇為碳源的BMMY培養(yǎng)基，在30℃、230 r/min下培養(yǎng)24 h，36 h收集菌體，PBS清洗1次，提取RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，熒光定量檢測下游基因表達量。

1.2.4 Ptp誘導表達 通過NCBI數(shù)據(jù)庫報道的ptp基因序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司對ptp序列進行密碼子優(yōu)化，6His-PTP連到pSVT7載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21，保存菌株。接種LB（15 μg/mL 四環(huán)素）的液體培養(yǎng)基，37℃，230 r/min培養(yǎng)過夜（14 h）。測定OD600，并按照初始0.1接種于TB/SB（含15 μg/mL 四環(huán)素）培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min培養(yǎng)5 h，然后加入不同體積的IPTG進行誘導23℃，230 r/min培養(yǎng)16 h，收集菌體。超聲波破碎細胞，提取總蛋白，磷酸酶的Ptp Western blot檢測，總蛋白SDS-PAGE電泳后，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST清洗3次，每次5 min。使用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入HRP標記的鼠抗His6抗體（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min，使用化學發(fā)光的方法顯影，曝光時間 1 s［14-15］。

1.2.5 Ptp蛋白純化 將pSVT7PTP-BL21（DE3）按照最優(yōu)的發(fā)酵條件進行誘導表達，5 500 r/min收集菌體，加入與培養(yǎng)基等體積的上樣緩沖液（20mmol/L NaH2PO4·2H2O、50 mmol/L NaCl，pH = 8.0）重懸。冰上預(yù)冷后進行超聲破碎，破碎時間25 min，8 800 r/min離心收集上清。將上清用0.22 μm針頭式濾器進行過濾，作為待純化的樣品。實驗采用AKTA-purifier 蛋白純化儀進行純化，將濾出液經(jīng)過Ni agarose蛋白純化柱進行親和層析，使用上樣緩沖液平衡5CV以洗去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，再用洗脫緩沖液（20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，50 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH8.0）洗脫，收集洗脫峰。將收集的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE檢測。將最優(yōu)條件下發(fā)酵純化的Ptp分裝保存于-80℃［16］。

1.2.6 蛋白磷酸酶Ptp酶活驗證 磷酸化多肽為底物，在蛋白金屬磷酸酶（PMP）緩沖液。添加1mmol/L MnCl2，反應(yīng)緩沖液，30℃溫育30 min，反應(yīng)體系如表3，ELISA檢測反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)液包板4℃過夜，使用1%BSA的PBST室溫封閉1 h，PBST洗板5遍，孵育相對應(yīng)的磷酸化抗體，室溫2 h，PBST洗板5次，室溫孵育HRP標記的兔抗二抗1 h，PBST洗板5遍，加入TMB室溫20 min，1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，多功能酶標儀檢測結(jié)果。

1.2.7 Mxr1磷酸化檢測 YPD過夜活化，OD=0.5轉(zhuǎn)接BMMY和BMGY，24 h，按照 1.2.3的方法取樣，統(tǒng)一OD600=4收集菌體，提取蛋白，經(jīng)過Bradford法蛋白質(zhì)定量，之后進行SDS-PAGE電泳后，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST清洗3次，每次5 min。使用1%的BSA封閉1 h，P215磷酸化抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜（14 h），TBST清洗3次，每次5 min，室溫孵育HRP標記的兔抗二抗1 h使用化學發(fā)光的方法顯影，曝光時間1 min。

表3 ELISA不同實驗中反應(yīng)類型

2 結(jié)果

2.1 Ptp與Mxr1相互作用

為了尋找與Mxr1相互作用的蛋白，我們將Mxr1前400氨基酸與GST標簽蛋白，表達純化，將靶蛋白- GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，用分別在甲醇和甘油培養(yǎng)的GS115蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳，切膠，經(jīng)過質(zhì)譜分析，得到其中一個蛋白為Ptp（圖1）。

圖1 Mxr1 PULL-DOWN 結(jié)果及Ptp條帶

2.2 驗證Ptp功能

為驗證Ptp的去磷酸化功能，在大腸桿菌表達，誘導表達純化脫鹽后，經(jīng)BCA法測得蛋白濃度是0.98 mg/L，以不同濃度pNPP為底物，相同體積酶反應(yīng)30℃，10 min，1 mol/L硫酸鈉終止反應(yīng)，405 nm測吸光強度，測得Ptp米氏常數(shù)Km= 2.023 mmol/L，最適酶促反應(yīng)溫度40℃，最適pH4.5（圖2）。

通過ELISA檢測酶促反應(yīng)結(jié)束后底物剩余量，將酶促反應(yīng)的底物包板，每孔包被5 mg磷酸化抗原多肽，或非磷酸化抗原多肽，孵育磷酸化抗體（稀釋比例 是 1∶2 000；1∶4 000；1∶8 000），通過加入純化的Ptp蛋白和只加入蛋白洗脫液對比（圖2-E），同樣的反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)加入Ptp的樣品幾乎沒有磷酸化抗原多肽剩余。說明純化出的Ptp蛋白有去磷酸化的蛋白活性。

2.3 Mxr1磷酸化情況

按照1.2.4的方法取樣，收集菌體，統(tǒng)一OD600=4收集菌體，提取蛋白，經(jīng)過BCA法蛋白質(zhì)定量，之后進行總蛋白SDS-PAGE電泳后，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育P215磷酸化抗體（1∶2000）使用化學發(fā)光的方法顯影，如圖3野生型GS115在甘油培養(yǎng)基里沒有發(fā)生磷酸化，在甲醇培養(yǎng)基里發(fā)生磷酸化，而Ptp高表達無論在甘油還是甲醇培養(yǎng)基都不發(fā)生磷酸化。

2.4 Mxr1定點突變和敲除在甲醇培養(yǎng)基中對與甲醇代謝相關(guān)基因的調(diào)控

敲除Mxr1后在BMMY培養(yǎng)基中Aox1幾乎不轉(zhuǎn)錄，與甲醇代謝相關(guān)的酶的轉(zhuǎn)錄水平嚴重下降，將磷酸化位點定點突變后，與甲醇代謝相關(guān)酶的基因表達量也有所下降，說明Mxr1的磷酸化修飾調(diào)控下游基因的表達，尤其是與甲醇代謝相關(guān)的基因的表達（圖4）。

3 討論

Aox1啟動子受甲醇誘導，但是其誘導機制到目前為止還沒有完全揭示清楚，而Mxr1是畢赤酵母Aox1啟動子的必要轉(zhuǎn)錄激活因子，為了研究甲醇的激活機理，先研究Mxr1激活機理，通過PULLDOWN發(fā)現(xiàn)與Mxr1相互作用的磷酸水解酶 Ptp，并對Ptp進行了高表達和敲除，發(fā)現(xiàn)在甲醇培養(yǎng)基中，高表達菌株Mxr1磷酸化程度遠遠高于敲除菌株。說明Ptp調(diào)控Mxr1磷酸化修飾。

本實驗用Mxr1特定位點磷酸化多肽作為底物，發(fā)現(xiàn)Ptp識別Mxr1S215位絲氨酸位點的磷酸化，并將該位點磷酸基團去除。將Mxr1S215位絲氨酸突變成丙氨酸后，通過熒光定量PCR檢測Mxr1野生型，敲除，定點突變菌株的下游基因表達量，發(fā)現(xiàn)與甲醇代謝相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變，其中Aox1、Aox2、Das1、Das2定點突變菌株轉(zhuǎn)錄量相對于野生型的下降接近60%。以上說明Mxr1 S215位磷酸化修飾，影響與甲醇代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。蛋白的磷酸化修飾與蛋白的結(jié)構(gòu)，亞細胞定位，功能息息相關(guān)［17-18］。Mxr1磷酸化修飾對其蛋白活性的影有可能是通過影響Mxr1空間結(jié)構(gòu)，進而影響Mxr1蛋白活性。

在釀酒酵母中，Ptp作為一個高度保守的小分子蛋白磷酸酶，在AMPK途徑發(fā)揮重要作用［12］，根據(jù)小分子磷酸酶的特性推測其底物有可能不止Mxr1一個，需要通過PULL-DOWN找與Ptp相互作用的蛋白。尋找在甲醇代謝通路中Ptp底物，從這些底物磷酸化修飾入手，揭示甲醇誘導代謝途徑所在的細胞信號通路。需要進一步驗證Mxr1第215位絲氨酸磷酸化與其亞細胞定位是否相關(guān)，Mxr1磷酸化修飾是否控制Mxr1進出細胞核，還是調(diào)控Mxr1的活性，同時尋找Mxr1其他磷酸化位點，進而揭示Mxr1激活A(yù)ox1轉(zhuǎn)錄的分子機理，以及甲醇誘導Aox1轉(zhuǎn)錄機理。最終減少甲醇的用量，提高利用Aox1啟動子表達外源蛋白生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及表達量。

圖2 Ptp蛋白外源表達純化后的酶學性質(zhì)研究

圖3 在分別用甲醇和甘油為唯一碳源培養(yǎng)時，野生型，高表達和敲除菌株的磷酸化水平

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)與Mxr1相互作用的磷酸酶 Ptp，驗證Ptp的功能是去除Mxr1S215位絲氨酸位點的磷酸基團。將Mxr1S215位絲氨酸突變成丙氨酸后，發(fā)現(xiàn)Aox1、Aox2、Das1、Das2定點突變菌株轉(zhuǎn)錄量相對于野生型的下降約60%。以上說明Mxr1 S215位磷酸化修飾，影響與甲醇代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

圖4 Mxr1磷酸化修飾對甲醇代謝相關(guān)基因表達的影響