張亞莉 陶妍 謝晶 錢韻芳

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

近年來，隨著水域環(huán)境的污染，水生生物遭受病原微生物侵染的問題越來越嚴(yán)重。而貝類等軟體動物雖然自身缺乏基于T淋巴細(xì)胞和免疫球蛋白的獲得性免疫功能，但卻能抵御環(huán)境中病原微生物的侵害，這種防御機制得益于其擁有內(nèi)源性的免疫系統(tǒng)［1］?？咕膭t是貝類先天性免疫系統(tǒng)的第一道防線，對于維持其機體的健康和穩(wěn)定起了關(guān)鍵性的作用，因此被認(rèn)為是開發(fā)天然抗菌劑的良好候選者。

目前，已經(jīng)報道的關(guān)于貝類抗菌肽的研究大部分聚焦于貽貝。Mitta等［2］在地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）和紫貽貝（Mytilus edulis）中發(fā)現(xiàn)了多種類型的抗菌肽，且各種類存在多樣性，他們按照這些抗菌肽在一級結(jié)構(gòu)和半胱氨酸數(shù)目上的差異將其分為4類：防御素（Defensins）、貽貝素（Mytilins）、貽貝肽（Myticins）和貽貝霉素（Mytimycin）。從地中海貽貝血淋巴中分離純化到的Defensin A和B均含有6個半胱氨酸殘基，可形成3個分子內(nèi)二硫鍵［3-4］；而從其血細(xì)胞和血清中分離到的Myticin A和B含有8個半胱氨酸殘基，兩者都可形成4個分子內(nèi)二硫鍵，但具有不同的半胱氨酸排列模式［5］。Mytimycin則是從紫貽貝的血清中分離得到的，包含12個半胱氨酸殘基，可形成6個分子內(nèi)二硫鍵［6］。至于Mytilins的成熟肽，由34個氨基酸殘基組成，含有8個半胱氨酸殘基，它們與Myticins的區(qū)別主要是成熟肽一級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基數(shù)目［7］。王日昕等［8］從厚殼貽貝（Mytilus coruscus）的血清中分離純化到3種Mytilin，分別命名為Mytilin-1、Mytilin-2和 Mytilin-3， 這 3種 Mytilin的成熟肽序列之間存在數(shù)個氨基酸殘基的差異。孫敬敬等［9］從厚殼貽貝的血清中分離到一種不同于上述4類抗菌肽的新型抗菌肽，將其命名為Mytichitin-A，該抗菌肽含6個半胱氨酸殘基，具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且具有較強的抑制革蘭氏陽性菌的活性。

迄今為止，已有一些厚殼貽貝來源的上述抗菌肽的重組DNA表達(dá)方面的研究報道。仲燕等［10］通過反轉(zhuǎn)錄從厚殼貽貝的血清中分離到Myticin A基因，并通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組Myticin A，發(fā)現(xiàn)它對巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）具有抑制作用；Meng等［11］則對厚殼貽貝血清中新分離到的Mytichitin A做了真核重組表達(dá)，證明重組蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的活性。武梅等［12］曾構(gòu)建了厚殼貽貝Mytilin-1，2，3的真核表達(dá)載體，但未能在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S78細(xì)胞中完成重組蛋白的表達(dá)。Shan等［13］通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了厚殼貽貝重組Mytilin-1成熟肽，證明該重組蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用。但是較之真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)存在一些眾所周知的缺點，如外源蛋白對宿主細(xì)胞容易產(chǎn)生毒害作用、新生肽鏈無折疊功能，并且易形成不溶的包涵體而喪失活性。據(jù)此，本研究擬通過建立厚殼貽貝Mytilin-1成熟肽的真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得具有良好抑菌活性的重組Mytilin-1，旨在為貝類來源的天然抗菌劑的基因工程制備提供技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸桿菌DH5α購自天根生物科技有限公司（北京）；畢赤酵母X-33和表達(dá)載體pPICZαA購自Invitrogen公司（美國）；用于抑菌試驗的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌屬（Escherchia coli）為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶（XhoI、XbaI和SacI）和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司（日本）；TaqDNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒小提試劑盒、YNB（無機氮源）和生物素購自天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；博來霉素購自Invitrogen公司；Western blot分析試劑購自康為世紀(jì)生物科技有限公司（北京）。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：10 .0 g/L蛋白胨、3.0 g/L牛肉浸出物、5. 0 g/L NaCl；YPD培養(yǎng)基：10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L瓊脂；MM培養(yǎng)基：13.4 g/L YNB、5 mL/L甲醇、0.4 mg /L生物素、15 g/L瓊脂；BMG培養(yǎng)基：13.4 g/L YNB、0.4 mg/L生物素、10 mL/L甘油、100 mmol/L磷酸緩沖液（pH6.0）；BMM培養(yǎng)基：13.4 g/L YNB、0.4 mg/L生物素、10 mL/L甲醇、100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的合成及重組表達(dá)載體的構(gòu)建 參考厚殼貽貝Mytilin-1的全長 cDNA 序列（GenBank登錄號：FJ973154.1），根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對編碼其成熟肽的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并在其5′端添加XhoⅠ酶切位點、Kex2信號肽酶切位點和6×His標(biāo)簽，在其3′端添加兩個終止密碼子（TAG和TAA）和XbaⅠ酶切位點；該目的基因被命名為“mMy1”，由上海生工生物工程有限公司合成。使用XhoI 和XbaI 對重組克隆質(zhì)?！癙UC-mMy1”進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因mMy1后，在T4 DNA連接酶作用下，如圖1所示，將其與被同樣酶處理過的表達(dá)載體pPICZαA連接（16℃，30 min），轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，通過雙酶切和DNA測序驗證重組表達(dá)載體pPICZαA-mMy1是否構(gòu)建成功。

圖1 重組表達(dá)載體pPICZαA-mMy1的構(gòu)建

1.2.2 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33及高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的篩選 使用SacI對重組表達(dá)載體pPICZαA-mMy1進(jìn)行線性化處理，將其電轉(zhuǎn)入80 μL畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中（1 500 V、25 μF、200 Ω、5 ms），加入1 mL 1 mol/L的山梨醇；另外，將pPICZαA空載體以同樣的方法電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中作為陰性對照；這些轉(zhuǎn)化子在YPD培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min 的條件下培養(yǎng)1.5 h，離心收集菌體涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPD平板上，29℃培養(yǎng)3 d；挑取長勢良好的菌落分別接種于含1 000 μg/mL博來霉素的YPD平板和MM平板上，篩選高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子。對篩選到的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，使用載體上的通用引物（5′AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′，3′ AOX1 ：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）進(jìn)行 PCR 鑒定。另一方面，對篩選到的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序。

1.2.3 重組mMy1的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取3個陽性轉(zhuǎn)化子接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，29℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h；取500 μL轉(zhuǎn)接至50 mL BMG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為2.0-4.0，離心收集菌體重懸于1 000 mL BMM培養(yǎng)基中，29℃、250 r/min下，1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h；在同樣條件下對陰性對照進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析 培養(yǎng)液經(jīng)離心后取上清用于Tricine-SDS-PAGE分析［14］，分離膠和濃縮膠濃度分別為16.5%和4%。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE后的凝膠電轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上，用封閉液對膜處理1.5 h，之后用TBST洗膜，加入抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體，孵育2 h后再用TBST洗膜；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，孵育1 h后洗膜；采用 HRP-DAB 顯色試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.5 抑菌實驗 將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，各取1 μL與100 μL 含重組mMy1的培養(yǎng)液上清混合，37℃孵育2 h后取30 μL涂布于LB平板，37℃培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌生長情況。另外，將1 μL菌液與100 μL 含pPICZαA 空載體的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清混合，同上處理作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 密碼子優(yōu)化后的目的基因mMy1及其重組表達(dá)載體pPICZαA-mMy1的鑒定

目的基因mMy1的cDNA序列及其推斷的氨基酸序列如圖2所示，它由144 bp組成，5′端依次含XhoI位點、信號肽酶切位點（KR）的密碼子和6×His的密碼子，3′端含XbaI位點和兩個終止密碼子。mMy1有8個保守的半胱氨酸殘基，它們在空間上能形成4對二硫鍵而穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通過ExPASy軟件預(yù)測，mMy1的理論分子量為4.8 kD、等電點為9.63。

對含pPICZαA-mMy1的大腸桿菌DH5α進(jìn)行菌落PCR發(fā)現(xiàn)，在理論位置646 bp處有明亮條帶（圖3-A）；另外，對pPICZαA-mMy1進(jìn)行XhoI和XbaI雙酶切，結(jié)果如圖3-B所示，在約144 bp處的小分子量條帶與理論值相符。另外，DNA測序結(jié)果表明重組表達(dá)載體pPICZαA-mMy1已構(gòu)建成功。

2.2 甲醇利用快速型高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定

通過含高濃度博來霉素的YPD平板和MM平板篩選到7株長勢良好的酵母轉(zhuǎn)化子，提取它們的DNA 作為模板，使用表達(dá)載體上的通用引物5′AOX1和3′ AOX1進(jìn)行PCR鑒定；電泳結(jié)果顯示：與陰性對照相比，7個轉(zhuǎn)化子均在近700 bp處有明顯條帶（圖4），與646 bp的理論分子量相符，證明pPICZαA-mMy1已成功嵌合進(jìn)酵母基因組中。

圖2 厚殼貽貝mMy1成熟肽的cDNA及推斷的氨基酸序列

圖3 pPICZαA-mMy1的菌落PCR（A）和雙酶切鑒定（B）

圖4 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果

選取圖4中的2號、3號和4號3株酵母轉(zhuǎn)化子，在29℃、250 r/min條件下，使用1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h，對它們的培養(yǎng)液上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示（圖5）：2號轉(zhuǎn)化子在7.8-14.4 kD處有一個明顯的條帶，而陰性對照的培養(yǎng)液上清則無此條帶，故基本證明重組mMy1在畢赤酵母X-33中被表達(dá)。值得注意的是，重組mMy1的理論分子量為4.8 kD，但Tricine-SDS-PAGE的分子量偏高，其原因可能是因為重組mMy1的分子量太小且?guī)д姾?，使得SDS對其電荷不能完全屏蔽，導(dǎo)致電泳時遷移速度變慢。

另一方面，Western blot分析結(jié)果顯示（圖6）：在10 kD處有明顯的雜交條帶，而陰性對照則未見任何條帶，表明了帶有6×His標(biāo)簽的目的蛋白與抗His的鼠單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG反應(yīng)，經(jīng)底物顯色，顯示為雜交條帶，故進(jìn)一步證明重組mMy1在畢赤酵母 X-33中成功表達(dá)。但顯示的雜交條帶的分子量更高，這可能是因為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)與顯色染料發(fā)生共價偶聯(lián)后在電泳時遷移速度變慢。

圖5 培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析

圖6 培養(yǎng)液上清的Western blot分析

2.4 重組mMy1的抑菌活性

由圖7所示，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌分別與含重組mMy1的培養(yǎng)液上清作用后，平板上的菌落數(shù)明顯減少；而陰性對照（不含重組mMy1的培養(yǎng)液上清）對上述3種細(xì)菌無抑制作用，據(jù)此可初步證明重組mMy1具有良好的抑菌活性。

圖7 含重組mMy1的培養(yǎng)液上清的抑菌活性

3 討論

厚殼貽貝來源的抗菌肽中，Mytilin是相對豐度較高、同工型最多的一種抗菌肽，它們在厚殼貽貝的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了很重要的作用。參考王日昕等［8］在厚殼貽貝的血清中分離到的編碼Mytilin-1的cDNA序列，根據(jù)Graphical Codon Usage Analyser（http：//www.gcua.schoedl.de/）預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)該cDNA中存在7個對于畢赤酵母來說的低頻密碼子，并對這些密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。Zhou等［15］對樹舌靈芝中的兩種新型真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fungal immunomodulatory proteins，F(xiàn)IPs）的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，重組蛋白的產(chǎn)量顯著提高；王方芹等［16］對黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶基因rha進(jìn)行了密碼子優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，重組蛋白的酶活力提高了2.7倍。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有利于外源蛋白的分泌表達(dá)、具有良好的翻譯后折疊修飾功能，便于獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白［17］；并且在促進(jìn)二硫鍵形成方面比大腸桿菌更有效［18］，這對于富含二硫鍵的Mytilin-1來說尤為重要。近年來，我們致力于魚貝類來源抗菌肽的真核重組表達(dá)，已經(jīng)通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus） 來源的重組表達(dá)的c型溶菌酶［19］、LEAP2［20］和 hepcidin［21］，以及三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的重組 c型溶菌酶［22］。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，甲醇濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時間是影響目的蛋白表達(dá)的兩個重要因素。甲醇濃度過低（＜1%）會導(dǎo)致小分子量的雜蛋白出現(xiàn)；反之，則對畢赤酵母工程菌的生長有影響。而表達(dá)時間過長，會使培養(yǎng)液的pH降低而影響目的蛋白的活性。據(jù)此，本研究確定的目的重組蛋白的表達(dá)條件為在29℃、250 r/min、pH 6.0條件下，使用1.0%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h。

雖然如上所述，對目的基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，但重組mMy1的表達(dá)量較低，僅為2 mg/L，其原因可能與重組mMy1的分子量偏小且?guī)д姾捎嘘P(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，小分子外源蛋白對宿主菌具有潛在的殺傷作用，而陽離子肽在表達(dá)過程中易被蛋白酶降解［23］。近來，Liang等［24］報道了將抗乙肝病毒表面抗原單鏈抗體（HBscFv）的基因與γ干擾素（IFNγ）的基因連接，在畢赤酵母X-33中進(jìn)行融合表達(dá)，獲得的重組HBscFv-IFNγ顯示了對乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）的結(jié)合活性。因此，進(jìn)一步的研究將聚焦于mMy1與大分子蛋白質(zhì)基因的串聯(lián)，以期實現(xiàn)重組融合蛋白的表達(dá)，進(jìn)而獲得高表達(dá)量的目的蛋白。

本研究獲得的重組mMy1對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌以及革蘭氏陰性的大腸桿菌都顯示了抑菌活性，這與Shan等［13］的研究結(jié)果基本一致，他們通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組厚殼貽貝Mytilin-1成熟肽，該重組蛋白顯示了對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性。重組mMy1的抑菌活性可能與其攜帶的15個堿性氨基酸中的8個精氨酸有關(guān)，因帶較多的正電荷，它能夠與細(xì)菌細(xì)胞膜表面所含的帶負(fù)電荷的酸性脂質(zhì)作用，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜［25］，其抑菌機理還有待于進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對編碼厚殼貽貝Mytilin-1成熟肽的密碼子進(jìn)行優(yōu)化合成，通過構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-mMy1，在畢赤酵母X-33中，于29℃、250 r/min條件下，經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h，成功獲得重組目的蛋白mMy1；抑菌試驗證明該重組蛋白對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌以及革蘭氏陰性的大腸桿菌均有明顯的抑菌活性。