朱銳 葉雨情 王雅欣 楊晨茹 王紅偉 孫曉晴 張研李尚琪 李炯棠

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動(dòng)物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100141）

孕激素調(diào)控硬骨魚類性腺發(fā)育、配子成熟和細(xì)胞增殖等重要生物過程［1-5］。目前研究認(rèn)為在硬骨魚類中類固醇激素調(diào)控作用可通過快速、非基因作用的膜受體介導(dǎo)，也可通過緩慢、經(jīng)基因作用的核激素受體介導(dǎo)［6］。孕激素受體（Progesterone receptor，Pgr）屬于后者，是一類以孕激素為配體的轉(zhuǎn)錄因子［7］，介導(dǎo)孕激素通過基因作用。硬骨魚類Pgr包括核激素受體域超家族和鋅指結(jié)構(gòu)域2個(gè)功能域。核激素受體域特異性識(shí)別并結(jié)合類固醇激素，是Pgr結(jié)合類固醇激素的功能域。鋅指結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合功能和轉(zhuǎn)錄因子活性，以識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的孕激素響應(yīng)位點(diǎn)并激活靶基因表達(dá)［8］，是Pgr發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用的功能域。核激素受體域結(jié)合類固醇激素后，改變Pgr蛋白構(gòu)象，使得Pgr鋅指結(jié)構(gòu)域能結(jié)合到靶基因序列上。

Pgr介導(dǎo)孕激素調(diào)控魚類性腺發(fā)育和生殖細(xì)胞成熟［3，9-10］。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）Pgr可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟［11］。雄性羅非魚（Oreochromis niloticus）Pgr敲除后導(dǎo)致不育［12］。鑒于Pgr在孕激素調(diào)節(jié)魚類生殖發(fā)育的重要作用，已有研究通過調(diào)控Pgr表達(dá)以影響魚類生殖發(fā)育。用拮抗劑米非司酮抑制Pgr表達(dá)可阻礙羅非魚精子發(fā)生［13］。

Pgr在大多數(shù)二倍體魚類中僅以一個(gè)拷貝存在。在多倍體魚類中Pgr存在多個(gè)拷貝。Lien等［14］通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)大西洋鮭（Salmon salar）中存在復(fù)制Pgr基因。相比二倍體硬骨魚類，鯉（Cyprinus carpio）具有特異的全基因組復(fù)制事件［15］，導(dǎo)致鯉染色體數(shù)目（100條）比其他二倍體魚類多一倍，被認(rèn)為是四倍體魚類。因此，鯉基因比其他魚類多一份拷貝［16］。目前關(guān)于二倍體硬骨魚Pgr的作用機(jī)制研究廣泛［17-19］。但關(guān)于多倍體魚類中復(fù)制Pgr基因的表達(dá)及功能研究尚未見報(bào)道。多拷貝Pgr基因間是否發(fā)生功能或者表達(dá)分化，彼此間在作用機(jī)制上是否存在競(jìng)爭(zhēng)或者協(xié)同關(guān)系，這些問題尚未闡明。對(duì)多倍體魚類Pgr開展深入研究，有助于我們進(jìn)一步了解其作用機(jī)理。關(guān)于養(yǎng)殖魚類生殖發(fā)育遺傳調(diào)控機(jī)制研究一直是重要研究熱點(diǎn)［20-21］。本實(shí)驗(yàn)克隆得到鯉兩種Pgr基因，研究它們的時(shí)空表達(dá)模式和表達(dá)分化趨勢(shì)，旨為研究多倍體魚類Pgr調(diào)控生殖發(fā)育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

所用10尾鯉的14個(gè)組織樣品（腦、肌肉、鰓、脾、腎、腸、胰腺、皮膚、精巢、卵巢、血液、心、眼和肝）不同時(shí)期胚胎，出膜后2 d幼苗和催產(chǎn)素刺激后的鯉均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院房山基地松浦鏡鯉。14個(gè)不同時(shí)期胚胎包括受精后0、0.5、1.5、2、2.5、3、4、5、7、9、11、24、36 和 72 h。每個(gè)發(fā)育時(shí)期收集50-60顆胚胎。采集20尾出膜后2 d幼苗。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 對(duì)親魚注射促黃體素釋放激素2號(hào)和馬來酸地歐酮（寧波第二激素廠，浙江）進(jìn)行人工催產(chǎn)［22］。雌魚注射劑量分別為2 mg/kg和5 μg/kg，雄魚使用劑量為雌魚的一半。注射上述催產(chǎn)素7-9 h后收集卵細(xì)胞和精液。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成 在加有液氮的研缽中將樣品研磨至粉末狀后，使用Trizol（Invitrogen，美國）提取RNA。用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)RNA的純度、濃度和完整性。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo，美國）反轉(zhuǎn)cDNA第一鏈。

1.2.3 全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增和序列分析 用Blastx將 斑 馬 魚（Danio rerio）Pgr蛋 白（GenBank號(hào)：NP_001159807.1）比對(duì)到鯉基因組和預(yù)測(cè)基因集（GenBank號(hào)：GCA_000951615.2） 上， 獲 得2種PgrmRNA（GenBank號(hào)：XM_019123336.1和XM_019122667.1）。這兩種基因分別位于鯉36號(hào)染色體和35號(hào)染色體。以這兩條mRNA為參考，分別設(shè)計(jì) 5′RACE 引物和 3′RACE 引物（表 1）。以卵巢總 RNA 為模板，按照 SMARTer RACE 5′/3′Kit試劑盒（Clontech，日本）方法分別獲得2種基因5′RACE產(chǎn)物。按照 3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase 試劑盒（TaKaRa，日本）獲得3′RACE產(chǎn)物。將產(chǎn)物連接到pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)染到Trans1-T1，在LB培養(yǎng)基中篩選陽性克隆。對(duì)單克隆進(jìn)行菌落PCR，產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序。測(cè)序產(chǎn)物與上述mRNA拼接，獲得cDNA全長(zhǎng)序列。

用 Blastn將Pgr1和Pgr2序列比對(duì)到對(duì)應(yīng)的染色體序列上，用GSDS［23］繪制2個(gè)基因的結(jié)構(gòu)圖。用DNAstar 5.0.1預(yù)測(cè)Pgr1和Pgr2蛋白。用Interproscan［24］識(shí)別Pgr1和Pgr2結(jié)構(gòu)功能域和預(yù)測(cè)Gene Ontology（GO）功能。

表1 鯉Pgr1和Pgr2RACE擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物

1.2.4 保守性和進(jìn)化分析 用Blastp分別將鯉Pgr1、Pgr2和斑馬魚Pgr兩兩比對(duì)，比較三者間一致性。利用ClustalW［25］構(gòu)建3種蛋白間的多重序列比對(duì)，鑒定高保守區(qū)域。除鯉和斑馬魚外，選擇如下物種Pgr構(gòu)建進(jìn)化樹，包括羅非魚、半滑舌鰨、鯽（Carassius auratus）、 紅 鰭 東 方鲀（Takifugu rubripes）、亞馬遜花鳉（Poecilia formosa）、青鳉（Oryzias latipes）、大西洋鱈（Gadus morhua）、三刺魚（Gasterosteus aculeatus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、小鼠（Mus musculus）和雞（Gallus gallus）。用Clustal W構(gòu)建多重序列比對(duì)后，用MEGA［26］構(gòu)建進(jìn)化樹，選擇Neighbor-Joining法進(jìn)行 1 000 次 bootstrap。利用 PAL2NAL［27］分別計(jì)算鯉Pgr1和斑馬魚Pgr、鯉Pgr2和斑馬魚Pgr、鯉Pgr1和Pgr2間的非同義替換率與同義替換率比值，以進(jìn)行種間和種內(nèi)的適應(yīng)性進(jìn)化分析。

1.2.5 表達(dá)模式分析 用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)Pgr1和Pgr2在組織、胚胎和催產(chǎn)素處理后的表達(dá)量。反應(yīng)體系如下：cDNA模板（200 ng/μL）1 μL，正向引物 /反向引物（10 μmol/L）各 0.2 μL（表 1），SYBR?Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo， 日本）7.5 μL，加ddH2O至15 μL。每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)技術(shù)重復(fù)。以 β-actin為內(nèi)參基因［28］，用 2-ΔΔCt法［29］相對(duì)定量基因表達(dá)，表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）來表示，用Student′st-test比較兩種基因在樣本的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Pgr1、Pgr2克隆和序列分析

Pgr1全長(zhǎng)cDNA序列為2 713 bp（GenBank：MH778546）， 編 碼 628個(gè) 氨 基 酸（GenBank：BAQ02892.1）。Pgr2全 長(zhǎng) cDNA 序 列 為 2 730 bp（GenBank：MH778547），編碼628個(gè)氨基酸（GenBank：BAQ02893.1）。兩種基因cDNA一致性為91%，蛋白一致性為90%。Pgr1由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)度為7 124 bp。Pgr2由8個(gè)外顯子與7個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)度為8 376 bp。蛋白結(jié)構(gòu)功能域結(jié)果顯示，與其他魚類Pgr相似，Pgr1和Pgr2都有鋅指結(jié)構(gòu)域和核激素受體域超家族2個(gè)功能域（圖1）。Pgr1鋅指結(jié)構(gòu)域分布于251-340位氨基酸，核激素受體域超家族分布于381-627位氨基酸。Pgr2鋅指結(jié)構(gòu)域分布于251-339位氨基酸，核激素受體域超家族位于380-627位氨基酸。這兩個(gè)功能域在Pgr1和Pgr2的分布位置一致。GO功能信息結(jié)果顯示Pgr1和Pgr2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能（GO：0006355），并參與轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0003700）、類固醇激素受體活性（GO：0003707）、DNA結(jié)合（GO：0003677）和鋅離子結(jié)合（GO：0008270）等生物學(xué)過程。

圖1 多種魚Pgr蛋白功能域

2.2 Pgr1和Pgr2的保守性和進(jìn)化分析

進(jìn)化樹顯示鯉Pgr1和鯽Pgr1聚為一簇，鯉Pgr2與鯽Pgr2聚為一簇。這兩支再與斑馬魚Pgr聚為一大支。而其他魚類Pgr聚為另外一大支（圖2）。這些結(jié)果表明，表明Pgr1和Pgr2出現(xiàn)在鯉與鯽的共同祖先種中，且晚于該祖先種和斑馬魚分化后；推測(cè)該祖先種發(fā)生全基因組復(fù)制事件。

同源序列比對(duì)顯示鯉Pgr1和斑馬魚Pgr蛋白一致性為84%，Pgr2和斑馬魚Pgr蛋白一致性為82%。比對(duì)結(jié)果顯示這3個(gè)基因在鋅指結(jié)構(gòu)域和核激素受體域區(qū)域高度保守，而非功能域的保守性較低（圖3）。適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)果顯示，鯉Pgr1與斑馬魚Pgr的非同義替換率與同義替換率比值為0.189，鯉Pgr2與斑馬魚Pgr的非同義替換率與同義替換率比值為0.190，鯉Pgr1與Pgr2的非同義替換率與同義替換率比值為0.360，表明Pgr1和Pgr2在種間和種內(nèi)受負(fù)選擇壓力。

基因組共線性結(jié)果顯示（圖4），斑馬魚Pgr鄰近區(qū)域和鯉Pgr1鄰近區(qū)域有高保守的共線性。斑馬魚Pgr鄰近區(qū)域有7個(gè)基因，包括Yap1（Yesassociated protein 1）、Cep126（Centrosomal protein of 126）、Trpc6（Transient receptor potential channel 6-like）、Arhgap42（Rho GTPase-activating protein 42-like）、Cntn5（Contactin 5-like，）、Fbxo40（F box only protein 40） 和Ttc36（Tetratricopeptide repeat domain 36）。除Fbxo40外，7個(gè)基因在斑馬魚Pgr鄰近區(qū)域和鯉Pgr1鄰近區(qū)域呈現(xiàn)一致性排列。而斑馬魚Pgr基因鄰近區(qū)域和鯉Pgr2基因鄰近區(qū)域僅有3個(gè)基因（Trpc6、Pgr和Arhgap42）呈現(xiàn)一致性排列。

2.3 Pgr1和Pgr2在組織的特異性表達(dá)

在14個(gè)組織的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明（圖5），Pgr1在精巢表達(dá)量最高；其次是卵巢，在鰓、腎臟和皮膚的表達(dá)量極低。Pgr2在精巢表達(dá)量最高；其次是卵巢，在眼、血液和心的表達(dá)量極低。Pgr1在精巢、卵巢、眼、血液和腸中顯著高于Pgr2（P＜0.05），在脾、肌肉、肝和心的表達(dá)量略高于Pgr2。而胰腺、腦、鰓、腎和皮膚中Pgr2的表達(dá)量顯著高于Pgr1（P＜ 0.05）。

圖2 Pgr系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3 鯉、鯽Pgr1、Pgr2與斑馬魚Pgr蛋白序列比對(duì)

圖4 鯉Pgr1、Pgr2與斑馬魚Pgr的基因組共線性

圖5 不同組織中Pgr1和Pgr2的表達(dá)

2.4 鯉Pgr1和Pgr2在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式

在15個(gè)發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明（圖6），Pgr1在受精后36 h的表達(dá)量最高，其次是1.5 h和4 h的表達(dá)量。Pgr2在受精后1.5 h的表達(dá)量最高。二者的表達(dá)模式各異。Pgr1在12個(gè)時(shí)期的表達(dá)量顯著高于Pgr2（P＜0.05），其余3個(gè)時(shí)期（0.5、2和24 h）也略高于Pgr2，表明在發(fā)育時(shí)期中Pgr1是主要表達(dá)基因。

圖6 在不同發(fā)育時(shí)期Pgr1和Pgr2的表達(dá)

2.5 催產(chǎn)素誘導(dǎo)后Pgr1和Pgr2的表達(dá)分析

催產(chǎn)素誘導(dǎo)后的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明（圖7），Pgr1在精液的表達(dá)量最高，在卵細(xì)胞中次之，在受精卵的表達(dá)量最低。Pgr2的表達(dá)模式與Pgr1相同，在精液表達(dá)量最高，其次是卵細(xì)胞和受精卵。盡管二者在催產(chǎn)素誘導(dǎo)后表達(dá)趨勢(shì)相同，但是在精液和卵細(xì)胞中Pgr1的表達(dá)量顯著高于Pgr2（P＜0.05）。綜合這些表達(dá)結(jié)果，推測(cè)主要是Pgr1參與催產(chǎn)素促進(jìn)魚類排精和產(chǎn)卵反應(yīng)。

圖7 在催產(chǎn)素誘導(dǎo)后Pgr1和Pgr2的表達(dá)

3 討論

Pgr是介導(dǎo)孕激素調(diào)控魚類性腺發(fā)育和生殖細(xì)胞成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子［30］。它通過核激素受體域超家族結(jié)合孕激素后，使得鋅指結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，結(jié)合到目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域上以激活目標(biāo)基因。這2個(gè)功能域是Pgr結(jié)合孕激素和發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用的重要結(jié)構(gòu)［31］。目前對(duì)二倍體魚Pgr的克隆、表達(dá)和功能研究比較詳實(shí)［32-33］，但關(guān)于多倍體魚類Pgr表達(dá)功能研究未見報(bào)道。目前僅Lien等［14］在大西洋鮭基因組預(yù)測(cè)到兩種Pgr基因。本研究克隆得到鯉兩種Pgr基因，cDNA序列長(zhǎng)度相近，蛋白序列長(zhǎng)度相同。cDNA相似性為91%，蛋白相似性為90%，表明多倍體魚類可能存在Pgr多個(gè)拷貝基因，而且序列一致性很高。鯉Pgr1和Pgr2包含核激素受體域超家族和鋅指蛋白域。這與其他魚類Pgr包含的功能結(jié)構(gòu)域相同［33-34］。鯉Pgr1和Pgr2與斑馬魚Pgr一致性分別為84%和82%。多重比較分析結(jié)果顯示，物種間Pgr的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域高度保守，這可能與該基因在不同物種間的相似性功能有關(guān)。GO注釋信息也支持這兩種基因都具有類固醇激素受體活性。綜合序列保守性、結(jié)構(gòu)域分析和GO功能，提示這2種Pgr基因都可能介導(dǎo)孕激素調(diào)控魚類性腺發(fā)育和生殖細(xì)胞成熟的反應(yīng)。

為確定鯉Pgr1和Pgr2的組織表達(dá)特性，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)它們?cè)诮M織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示Pgr1和Pgr2在精巢表達(dá)量最高，其次是卵巢。這兩個(gè)組織的表達(dá)量顯著高于其他組織，呈現(xiàn)組織特異性。這與Pgr調(diào)控性腺發(fā)育的功能相符合。該結(jié)果與目前已報(bào)道的魚類Pgr在精巢和卵巢高表達(dá)情況一致［5，9］。催產(chǎn)素刺激后Pgr1和Pgr2在精液表達(dá)量最高，其次是卵細(xì)胞，受精后表達(dá)量下降，暗示這2個(gè)基因參與催產(chǎn)素促進(jìn)魚類排精和產(chǎn)卵反應(yīng)。盡管鯉Pgr1和Pgr2在序列同源性、蛋白結(jié)構(gòu)域和組織表達(dá)特異性存在相似性，但是二者在基因結(jié)構(gòu)、基因組共線性和表達(dá)量存在差異。Pgr1和Pgr2基因長(zhǎng)度、外顯子數(shù)量和內(nèi)含子長(zhǎng)度有較大差異。鯉Pgr1與斑馬魚Pgr的一致性更高（84%）。Pgr1鄰近基因與斑馬魚Pgr基因的一致性排列更保守。這些結(jié)果暗示相比Pgr2，Pgr1的功能更接近斑馬魚Pgr。組織分布結(jié)果、發(fā)育時(shí)期表達(dá)結(jié)果以及催產(chǎn)素誘導(dǎo)表達(dá)變化顯示，Pgr1在大多數(shù)狀態(tài)下的表達(dá)量顯著高于Pgr2，表明Pgr1是介導(dǎo)魚類性腺發(fā)育和產(chǎn)卵排精的主表達(dá)基因。本研究發(fā)現(xiàn)Pgr1和Pgr2在性腺和配子中差異表達(dá)，暗示它們?cè)谡{(diào)控鯉性腺發(fā)育和配子成熟的作用已經(jīng)分化。這2種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是否存在變異，以及表達(dá)水平為何有差異，將是下一步研究?jī)?nèi)容。

4 結(jié)論

克隆獲得鯉2種Pgr基因，Pgr1和Pgr2。二者cDNA序列長(zhǎng)度相近，核酸和蛋白質(zhì)序列相似性高，均具有核激素受體域超家族和鋅指蛋白域。這2個(gè)基因在進(jìn)化過程中保守，與斑馬魚Pgr高度同源。組織表達(dá)譜顯示，二者在性腺的表達(dá)顯著高于其他組織。催產(chǎn)素誘導(dǎo)后二者在生殖細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于受精卵。這2個(gè)基因可能參與調(diào)控鯉性腺和生殖細(xì)胞成熟。但Pgr1與斑馬魚的同源性高于Pgr2，Pgr1基因組共線性比Pgr2更保守，在大部分組織、發(fā)育時(shí)期和催產(chǎn)素刺激后Pgr1表達(dá)量高于Pgr2，表明Pgr1是介導(dǎo)孕激素作用的主要基因。