張卓 劉茂炎 王培 黃文坤 劉二明 彭煥 彭德良

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 湖南省植物保護(hù)研究所 園藝作物病蟲害治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

自1994年美國(guó)獲準(zhǔn)抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因大豆商業(yè)化種植以來，種植面積逐年增加，2017年全球種植面積達(dá)9 410萬hm2，占所有轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%［1］。隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)步驟的加快，轉(zhuǎn)基因作物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)備受關(guān)注［2-5］。轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境和微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及多樣性的影響是其安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容［6］，土壤-微生物-作物三者互作的特殊微生態(tài)系統(tǒng)組成根際環(huán)境，根際環(huán)境是作物根系營(yíng)養(yǎng)成分吸收、新陳代謝和生長(zhǎng)的場(chǎng)所，根際微生物廣泛存在大豆根際生境中，并對(duì)大豆生長(zhǎng)產(chǎn)生多方面的影響［7］。轉(zhuǎn)基因作物種植后，其表達(dá)的外源基因產(chǎn)物進(jìn)入到土壤后，可能與土壤微生物發(fā)生作用從而影響其活動(dòng)和功能［8］。由于農(nóng)田中土壤微生物群落的組成和多樣性與作物的根際分泌物有關(guān)，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因作物的根際分泌物的變化導(dǎo)致其對(duì)土壤微生物群落的影響有所不同［9］。因此，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的多樣性、結(jié)構(gòu)和功能的影響是作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物安全的重要指標(biāo)之一［10］。此外，轉(zhuǎn)基因作物殘茬對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)、土壤特異生物功能團(tuán)、土壤生物多樣性也可能產(chǎn)生一定的影響［11］。

BIOLOG是描述微生物群落功能多樣性變化的重要指標(biāo)，它能代表實(shí)際土壤微生物群體對(duì)碳源利用的動(dòng)力學(xué)特征［12］。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米根際微生物群落功能多樣性與受體的相比無顯著性差異［13-15］，但轉(zhuǎn)Bt基因水稻SHK601與受體水稻相比對(duì)根際微生物群落功能有短暫影響［16］。不同耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)根際土壤固氮細(xì)菌多樣性的影響研究發(fā)現(xiàn)，耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆M88、GTS40-3-2 和非轉(zhuǎn)基因大豆中黃13 根際土壤固氮細(xì)菌多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)無顯著差異；抗蟲耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆ZB 根際土壤固氮細(xì)菌多樣性指數(shù)顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆中黃13，均勻度指數(shù)無顯著差異［15］。轉(zhuǎn)G10-EPSPS基因抗草甘膦大豆SHZD32-01和配施草甘膦處理后，顯著影響結(jié)莢期根際土壤細(xì)菌和根瘤菌的多樣性，但其影響隨大豆的生長(zhǎng)而逐漸消失［17］。王麗娟等［18］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆PAT和ALS根際土壤微生物活性均高于相應(yīng)親本，兩種轉(zhuǎn)基因大豆根際土壤微生物群落物種均一度和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)較對(duì)應(yīng)親本均無顯著差異，主成分分析發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因親本大豆ALS1 以及中黃13 土壤微生物群落碳源利用類型相似，僅轉(zhuǎn)基因大豆ALS 土壤微生物碳源利用類型表現(xiàn)出差異。

不同轉(zhuǎn)基因作物品種對(duì)土壤微生物群落的影響有一定的差異，基于轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的個(gè)案原則開展相關(guān)研究是其安全性評(píng)價(jià)的必要步驟。本研究以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆AG5601、親本SNK500及常規(guī)大豆中黃13為材料，采用BIOLOG-ECO技術(shù)，對(duì)成熟期和收割60 d后的根際殘茬根際微生物群落功能多樣性的差異進(jìn)行比較分析。其結(jié)果有助于解析抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆AG5601對(duì)根際微生物群落功能的影響及其對(duì)碳源利用的情況，為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試大豆品種 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆AG5601和親本非轉(zhuǎn)基因大豆SNK500由美國(guó)孟山都公司提供，當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)品種中黃13由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試驗(yàn)基地提供。

1.1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)和氣候條件 本試驗(yàn)于2016年在河北省廊坊市安次區(qū)炊莊中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)期間5-10月的月平均氣溫為20.6、23.7、27.4、25.0、19.4及14.5℃，平均降雨量 為 50.0 mm、67.9 mm、75.2 mm、75.2 mm、74.3mm及68.0 mm。

參照轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 耐除草劑大豆第4部分：“生物多樣性影響”（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2031號(hào)公告），試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理分別為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆AG5601、親本大豆SNK500和當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)品種中黃13，每個(gè)處理4次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)。小區(qū)采用隨機(jī)排列，小區(qū)間設(shè)有1.5 m寬的空白隔離帶，小區(qū)面積約150 m2（長(zhǎng)11.5 m，寬13.0 m）。2016年5月25日播種，試驗(yàn)小區(qū)常規(guī)管理，未施用化肥和農(nóng)藥，成熟期土壤的部分化學(xué)和生物學(xué)性狀如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品采集 于大豆成熟期和收割后60 d殘茬根部取樣，每小區(qū)隨機(jī)取10株，用小鏟子挖出根部，輕輕抖掉根系外圍土，用毛刷輕刷黏附在根表面的土壤作為根際土，用無菌的封口袋密封并充分混勻，過50目篩，作為1個(gè)土壤樣品。

表1 供試土壤的化學(xué)和生物學(xué)性狀

1.2.2 BIOLOG-ECO分析 土壤樣品在25℃條件下活化24 h，取3 g土放入27 mL 的0.85 mol/L NaC1溶液中，振蕩30 min后，吸取3 mL上清，加入27 mL NaC1溶液，混勻后再吸取3 mL上清，加入27 mL NaC1溶液；最終的稀釋比例為1∶1 000。向ECO板的各孔中加入150 μL的稀釋液，每個(gè)土樣3次重復(fù)，將接種好的微孔板放在保濕的容器中，并放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中。分別于0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228和 240 h在 ELxS08 Biolog微孔板讀數(shù)儀（BIO-TEK Instruments INC，USA）上進(jìn)行讀數(shù)并記錄。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用Excel對(duì)ECO板結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單孔的平均顏色變化率（AWCD）計(jì)算方法：

式中，C為處理每個(gè)碳源孔的光密度值；R為對(duì)照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

土壤微生物功能多樣性采用BIOLOG 培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以Simpson，Shannon和 McIntosh3種指數(shù)來表征土壤微生物群落功能多樣性。

Shannon指數(shù)H 用來估算群落多樣性的高低，計(jì)算公式如下：

其中pi為第i孔的相對(duì)吸光值（Ci-R）與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率

Simpson指數(shù)D，用于評(píng)估某些常見種的優(yōu)勢(shì)度，計(jì)算公式如下：

其中ni為第i孔的相對(duì)吸光值（Ci-R），N為相對(duì)吸光值總和；

Simpson指示用1/D值表示，

McIntosh指數(shù)U，反應(yīng)群落物種均一性，

ni同上。

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析和主成分分析，土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性指數(shù)的顯著性分析采用單因素方差分析，對(duì)微生物碳源利用進(jìn)行主成分分析。

圖1 AG5601，SNK500和中黃13根際微生物在BIOLOG-ECO板上的平均顏色變化率

2 結(jié)果

2.1 不同處理根際土壤微生物群落平均吸光值的變化

由圖1可以看出，AG5601成熟期的根際微生物群落AWCD在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)均顯著高于親本SNK500，培養(yǎng)72 h 后高于常規(guī)品種中黃13，但差異不顯著；說明AG5601根際微生物的生理活性顯著高于親本SNK500，但與中黃13根際微生物的生理活性相比無顯著性差異。殘茬期，AG5601、SNK500和中黃13大豆根際微生物群落AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物利用碳源量逐漸增加，非轉(zhuǎn)基因大豆SNK500和中黃13大豆根際微生物群落利用碳源量在144 h 后略高于AG5601，在整個(gè)培養(yǎng)過程中無顯著性差異。

在成熟期，AG5601與親本SNK500根際土壤微生物群落在McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù)差異顯著，AG5601、SNK500和中黃13根際微生物群落在Shannon指數(shù)無顯著性差異。AG5601與SNK500殘茬的根際土壤微生物群落的Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著差異，但與中黃13在McIntosh指數(shù)上差異顯著（表2）。

2.2 微生物群落功能主成分分析

主成分分析發(fā)現(xiàn)，AG5601、SNK500和中黃13成熟期的根際微生物群落在第1主成分上的得分沒有顯著性差異，AG5601在第2主成分上的得分與中黃13差異顯著，但與親本SNK500不顯著（圖2）。第1、2主成分貢獻(xiàn)率分別為81.88%和10.28%，累積貢獻(xiàn)率為92.16%，說明第1主成分是變異的主要來源，起主要參考作用。從31種碳源在2個(gè)主成分上的載荷值可知，除2-羥基苯甲酸外，其余30種碳源均集中在第1主成分上，決定了主成分1的分異，而影響主成分2的主要碳源主要是2-羥基苯甲酸、丙酮酸甲酯、α-環(huán)糊精、L-蘇氨酸、D-葡萄胺酸、甘油（表3）。綜合第1、2主成分分析結(jié)果：被AG5601和SNK500根際微生物群落特異利用的碳源有：D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、L-精氨酸、D-木糖、L-天冬酰胺酸、I-赤蘚糖醇、α-環(huán)糊精、L-蘇氨酸、D-葡萄胺酸、衣康酸、葡萄糖-L-谷氨酸、葡萄糖- L-磷酸、α-丁酮酸、a-D-乳糖。被中黃13特異利用的碳源有：β-甲基-D-葡萄苷、丙酮酸甲酯、D-半乳糖醛酸、土溫-40、2-羥基苯甲酸、L-苯甲基丙氨酸、土溫-80、D-甘露醇、4-羥基苯甲酸、L-絲氨酸、N-乙?；?D-葡萄胺、γ-羥基丁酸、肝糖、D-纖維二糖、苯基乙胺、甘油、D-蘋果酸、腐胺。說明在AG5601和SNK500成熟期，根際微生物在碳源的利用上保持一致。

表2 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆土壤微生物群落功能多樣性

圖2 土壤微生物碳源利用類型主成分分析（72 h）

主成分分析發(fā)現(xiàn)，AG5601、SNK500和中黃13殘茬的根際微生物群落在第1主成分上的得分基本一致，AG5601在第2主成分上的得分與SNK500差異不顯著，與中黃13差異顯著（圖2）。第1、2主成分貢獻(xiàn)率分別為65.92%和25.21%，累積貢獻(xiàn)率為91.13%，說明第1主成分是變異的主要來源，起主要參考作用。從31種碳源在2個(gè)主成分上的載荷值可見（表4），除D-半乳糖醛酸、2-羥基苯甲酸、D-甘露醇、4-羥基苯甲酸、N-乙?；?D-葡萄胺、D-葡萄胺酸不被根際微生物利用外，其他的25種碳源均被根際微生物利用（表4）。再從25種碳源在2個(gè)主成分上的載荷值可以看出，除L-天冬酰胺酸、腐胺外，其余23種碳源均集中在第1主成分上，決定了主成分1的分異，而影響主成分2的主要碳源主要是L-天冬酰胺酸、腐胺、L-精氨酸、葡萄糖-L-谷氨酸、苯基乙胺。綜合第1、2主成分結(jié)果，被AG5601和SNK500根際微生物群落特異利用的碳源有：L-精氨酸、丙酮酸甲酯、D-木糖、L-天冬酰胺酸、i-赤蘚糖醇、L-苯甲基丙氨酸、L-絲氨酸、γ-羥基丁酸、L-蘇氨酸、衣康酸、葡萄糖-1-磷酸、α-丁酮酸、苯基乙胺、甘油。被中黃13根際微生物群落特異利用的碳源有：β-甲基-D-葡萄苷、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、土溫-40、土溫-80、α-環(huán)糊精、肝糖、葡萄糖-L-谷氨酸、D-纖維二糖、α-D-乳糖、D-蘋果酸、腐胺。其他碳源則可被3種大豆的根際微生物群落共同利用或均不利用。說明AG5601和SNK500殘茬的根際微生物群落在碳源的利用上亦保持一致。

表3 ECO板上31種碳源在第一和第二主成分上的載荷值

3 討論

土壤根際微生物群落碳源的利用量代表著土壤中可培養(yǎng)微生物群落的數(shù)量。土壤微生物的數(shù)量是對(duì)土壤生態(tài)條件的綜合反應(yīng)，土壤微生物中的細(xì)菌、真菌、放線菌具有不同的生活習(xí)性，它們的數(shù)量變化和在土壤微生物中所占的比例對(duì)其生活的土壤生態(tài)條件具有一定的指示意義［19］。根際是植物與土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的活躍界面，植物同化大氣中的CO2，將部分光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至地下，促進(jìn)土壤微生物的生長(zhǎng)和新陳代謝；土壤中的微生物則將土壤中的有機(jī)態(tài)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化成無機(jī)形態(tài)，供給植物吸收利用［20］。

表4 轉(zhuǎn)基因大豆殘茬期ECO板上31種碳源在第一和第二主成分上的載荷值

近年來隨著新轉(zhuǎn)基因作物的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因作物的種植對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注［4-6］。土壤微生物作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物安全的重要指標(biāo)，其群落結(jié)構(gòu)多樣性直觀地反映轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的影響［10］。已有研究結(jié)果表明，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆與常規(guī)大豆根系分泌物相比，表明前者根系分泌物含有的氨基酸和碳水化合物的量更多，進(jìn)而對(duì)根際微生物產(chǎn)生一定影響［21］。本研究結(jié)果表明，AG5601與親本大豆SNK500成熟期的根際微生物群落的光密度差異顯著，而與中黃13根際微生物光密度不顯著，AG5601、SNK500和中黃13殘茬的根際微生物群落的光密度差異無顯著性差異。和以往的研究結(jié)果相比，不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因作物根系對(duì)土壤微生物的影響有所不同。呂曉波等［21］經(jīng)過連續(xù)3年的大田和盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆與親本相比，在不同生育期根際土壤細(xì)菌和放線菌均表現(xiàn)降低趨勢(shì)。葉飛等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在棉花的整個(gè)生育期土壤微生物群落的光密度差異不顯著，花鈴期轉(zhuǎn)基因棉花根際土壤微生物群落的光密度均低于對(duì)照。

研究根際微生物群落對(duì)不同種類碳源利用率的差異，能夠更全面地了解微生物群落代謝功能特征。本研究結(jié)果表明，在成熟期AG5601與SNK500根際土壤微生物McIntosh指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)均顯著高于中黃13，而AG5601、SNK500和中黃13殘茬的根際土壤微生物多樣性差異不顯著。王麗娟等［18］研究表明，轉(zhuǎn)基因大豆ALS 顯著提高了根際土壤微生物的物種香農(nóng)-維納指數(shù)。但并對(duì)土壤微生物群落的物種均一度和優(yōu)勢(shì)度未產(chǎn)生顯著影響。轉(zhuǎn)基因大豆PAT 的種植對(duì)根際土壤微生物的物種香農(nóng)-維納指數(shù)、物種均一度和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均未產(chǎn)生顯著影響。梁晉剛等［14］研究表明，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆及其受體大豆在豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)上均沒有顯著性差異。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉SGK321 及其親本棉石遠(yuǎn)321不同生長(zhǎng)時(shí)期其根際土壤微生物群落功能多樣性的變化研究表明，播種后30 d后，轉(zhuǎn)雙價(jià)棉根際土壤微生物群落豐富度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)顯著高于親本常規(guī)棉，而 90 d后，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根際土壤微生物群落豐富度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)則顯著低于親本常規(guī)棉［24］。以上結(jié)果表明，土壤微生物群落豐富度和優(yōu)勢(shì)度隨轉(zhuǎn)基因作物生長(zhǎng)時(shí)期的不同而異，但轉(zhuǎn)基因作物的對(duì)土壤微生物多樣性無顯著影響。

Garland 等［25］研究結(jié)果表明，主成分分析結(jié)果中各處理在空間上位置與微生物在碳源的利用能力密切相關(guān)。本研究主成分分析結(jié)果表明，AG5601、SNK500和中黃13根際微生物群落在第1主成分上的得分基本一致，說明轉(zhuǎn)基因大豆AG5601和非轉(zhuǎn)基因大豆SNK500和中黃13根際在碳源的利用上亦保持一致。王麗娟等［18］研究表明，轉(zhuǎn)基因大豆PAT、親本PAT1、非轉(zhuǎn)基因親本大豆ALS1 以及中黃13 土壤微生物群落碳源利用類型相似，僅轉(zhuǎn)基因大豆ALS 土壤微生物碳源利用類型表現(xiàn)出差異。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆AG5601種植后，對(duì)于微生物多樣性無顯著性影響，因此，轉(zhuǎn)基因大豆和常規(guī)品種種植后，根際土壤中微生物碳源利用上趨于穩(wěn)定。

近些年來用新方法分析土壤微生物群落取得了很大的進(jìn)步，但是這些方法對(duì)土壤微生物群落的全面了解具有局限性［26］。而底物碳源的多樣性為微生物的生長(zhǎng)提供了廣泛的選擇，從而使大多數(shù)可培養(yǎng)微生物均可在有31種碳源的微孔板上進(jìn)行生命活動(dòng)，并使微孔板發(fā)生顏色變化。土壤生態(tài)環(huán)境中微生物活性及群落多樣性受許多環(huán)境因子的影響，如土壤質(zhì)地結(jié)構(gòu)、土壤肥力、碳源、pH值、水分及植被類別等。而植物根系分泌的有機(jī)化合物是影響不同植物根際微生物多樣性的關(guān)鍵性因素［27］。由于土壤微生物受到的影響因子太多、太復(fù)雜，因此轉(zhuǎn)基因大豆影響土壤微生物的內(nèi)在機(jī)制及多種評(píng)價(jià)指標(biāo)有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，雖在成熟期AG5601根際微生物群落利用碳源高于SNK500，但AG5601殘茬的根際微生物群落的光密度低于SNK500和中黃13，說明轉(zhuǎn)基因大豆AG5601根系對(duì)土壤微生物群落活性的影響是短暫的。主成分分析發(fā)現(xiàn)，AG5601與SNK500在成熟期及收獲后的殘茬根際土壤微生物的碳源利用模式無差別，綜上所述，與對(duì)照相比，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆AG5601對(duì)根際微生物群落功能多樣性無顯著性影響。