龐鵬湘 常燕楠 尉瑞敏 郜剛

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004）

橡膠延長因子基因（Rubber elongation factor protein，REF）家族包括橡膠延長因子基因（Rubber elongation factor，REF）、小橡膠粒子蛋白（Small rubber particle protein，SRPP）和脅迫相關(guān)基因（Stress-related protein，SRP）［1］。其中 REF/SRPP 有REF結(jié)構(gòu)域，對橡膠的生物合成起決定性作用［2］。擬南芥SRPP在組織生長和發(fā)育以及干旱脅迫響應(yīng)中起重要作用［3］，擬南芥中有3種SRPP同源物，分別為SRP1、SRP2和SRP3，SRP在各組織中表達(dá)差異。由ABA和非生物脅迫誘導(dǎo)（干旱、高鹽度和低溫），與野生型相比，過表達(dá)SRP的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（35S：SRP1、35S：SRP2和35S：SRP3）具有更好的營養(yǎng)和生殖生長，并且對干旱脅迫具有更好的耐受性［3］。在云杉中通過半干燥處理后，SRP主要涉及滲透、內(nèi)源激素、抗氧化蛋白、分子伴侶和防御相關(guān)蛋白［4］。Sano等［5］研究表明在不同脅迫條件下（脫水脅迫、滲透脅迫、鹽脅迫、淹水脅迫、熱脅迫和冷脅迫），成熟種子中的SRP被誘導(dǎo)。Hong等［6］研究表明CaSRP1（Capsicum annuumstress-related protein 1）之前被鑒定為SRPPs同源物，在水分脅迫的條件，CaSRP1被誘導(dǎo)，相對于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中CaSRP1過表達(dá)導(dǎo)致耐旱性增強(qiáng)［7］。Eun等［8］研究表明SbSRP可能涉及ROS清除活性直接作為非酶抗氧化劑或間接誘導(dǎo)幾種編碼抗氧化酶的基因的表達(dá)。脅迫相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致代謝物的積累和生化和生理途徑的改變，這對于植物適應(yīng)不利脅迫條件是至關(guān)重要的。

目前，關(guān)于馬鈴薯StSRP1的表達(dá)、功能等相關(guān)研究，鮮見報道。有文章表明，水稻種子干燥階段中，脅迫相關(guān)蛋白在水稻種子成熟過程中對耐干性具有重要作用［5］，脅迫相關(guān)蛋白根據(jù)其生理功能分為3大類：分子伴侶（Molecular chaperones）、抗氧化蛋白（Antioxidative proteins）和晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白（Late embryogenesis abundant proteins，LEA）。分子伴侶通過促進(jìn)蛋白質(zhì)的天然折疊和防止變性蛋白質(zhì)的不可逆聚合，在應(yīng)答脅迫中發(fā)揮重要作用［9］。熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）在熱休克應(yīng)答中就是一大類分子伴侶，HSP通過蛋白質(zhì)之間的相互作用介導(dǎo)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，參與熱休克脅迫［10］；當(dāng)非生物脅迫破壞細(xì)胞的代謝平衡時，有害ROS的水平會增強(qiáng)，抗氧化蛋白參與抑制攻擊DNA，蛋白質(zhì)和膜的活性氧（ROS）的產(chǎn)生引起脂質(zhì)過氧化和脫酯化［11］；LEA蛋白在許多高等植物的種子中很豐富，并且可能普遍存在于植物種子中，LEA蛋白表達(dá)可以通過干燥脅迫或通過用ABA處理在植物的其他階段誘導(dǎo)［12］。

本研究采用電子克隆法，從馬鈴薯中克隆得到StSRP1序列，利用分子生物學(xué)公用數(shù)據(jù)庫，對基因的分子生物學(xué)特性、生化特性進(jìn)行分析，預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并對其進(jìn)行定量表達(dá)分析。為研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能以及驗證馬鈴薯StSRP1在抵抗生物脅迫過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用中薯3號馬鈴薯塊莖作為試驗材料，將其放在高壓滅菌的草炭/蛭石土（3∶1，V/V）的營養(yǎng)缽中，在光照強(qiáng)度2 000-3 000 lx、光照時間16 h/8 h（晝/夜）、23℃/18℃（晝/夜）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其長至7-8葉齡期，進(jìn)行處理。

選取生理小種3號（race3）、生化變種2號（biovar2）的PO41菌株作為病原菌，在鑒定培養(yǎng)基（TTC培養(yǎng)基）中純化，在擴(kuò)繁培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）中擴(kuò)繁。

1.2 方法

1.2.1 激素處理 根據(jù)Ni等［13］的方法，分別用50μmol/L 茉莉酸甲酯（MJ）、100 μmol/L 脫落酸（ABA，Sigma-Aldrich，St. Louis，USA）對馬鈴薯的7-8葉齡期幼苗進(jìn)行噴霧處理。用0.1%乙醇噴霧處理作為對照。所有處理后的樣品均用透明聚乙烯塑料袋覆蓋，以保持濕度，分別于1、2、3、4和5 d時對植物地上部分取樣，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 青枯菌處理 采用He等［14］的傷根灌菌法，通過分光光度計測量配置菌懸液濃度為108CFU/mL（A660=0.2）的菌液，取30 mL菌液接種至7-8葉齡期的幼苗，以水作為對照，分別于6、12、24、48和84 h對植株地上部分取樣，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆茫?5］。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成 利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取馬鈴薯地上部分總RNA。使用分光光度計法進(jìn)行定量檢測，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。樣品cDNA合成操作按照PrimeScripTMRT-PCR Kit說明書進(jìn)行。

1.2.4StSRP1的電子克隆 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的blastn（http ：/BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi）檢索前期工作中獲得的EST原始序列，找出其同源序列，發(fā)現(xiàn)與NCBI數(shù)據(jù)庫中XM_006359330.1相似性最高，為97%。通過bioedit軟件拼接序列，直到不能延伸。

1.2.5 StSRP1的生物信息學(xué)分析 利用BioEdit軟件分析基因序列并推導(dǎo)其相應(yīng)氨基酸序列。用ExPASy-ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列，用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜結(jié)構(gòu)，用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信號肽，用 NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸位點(diǎn)，利用WOLF PSORT Server（https：//wolfpsort.hgc.jp/）分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，用Pfam（https：//pfam.xfam.org/search）分析蛋白結(jié)構(gòu)域。

用 PSIPRED（http：//bioin f.cs.ucl.ac.uk/psipr ed/） 和 PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/sec pred_hnn.pl）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，CPHmodels（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

通過NCBI的BLAST進(jìn)行同源性分析，按照相似度由高到低的順序，選擇20條序列下載，利用MEGA 5.0軟件鄰接法（neighbor-joiningmethod，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用1 000 bootstrap replicates。

利用 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）搜索StSRP1啟動子的2 000 bp序列，通過分析目的基因的啟動子區(qū)域，找出轉(zhuǎn)錄基因的結(jié)合位點(diǎn)，從而分析目的基因受哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，定位潛在的順式作用元件。

1.2.6 實時熒光定量PCR 根據(jù)StSRP1序列設(shè)計特異性熒光定量引物（F：5′-CGGTGACATATGCGTCGGAG-3′和 R：5′-AACAGTGCCGTCGGTCAAGG-3′），正反引物各 0.4 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、模板（稀釋的 cDNA）2 μL，加ddH2O定容到20 μL。用Actin作為內(nèi)參基因（F：5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAG-3′和 R ：5′-CTCGCTCAGCTGTGGTGGTG-3′），

2 結(jié)果

2.1 StSRP1的生物信息學(xué)分析

2.1.1StSRP1序列 前期實驗構(gòu)建了病原誘導(dǎo)的馬鈴薯莖特異消減cDNA文庫，從該文庫中篩選出目的基因克隆，通過序列拼接獲得全長cDNA序列（Accession：MK224501），經(jīng)BLAST分析，該基因與Solanum tuberosumstress-related protein（Accession：XM_006359330.1）相似性高達(dá)97%，故命名StSRP1。該基因序列包含一個867 bp的開放讀碼框，編碼288個氨基酸（圖1）。

圖1 StCUL1的核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.1.2 StSRP1蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用ProtParam和ProScal進(jìn)行分析StSRP1理化性質(zhì)分析，蛋白的分子量是30.682 kD、等電點(diǎn)是5.22、不穩(wěn)定指數(shù)是38.19，該數(shù)值低于閾值40，為穩(wěn)定蛋白，StSRP1屬于不穩(wěn)定蛋白、半衰期在哺乳動物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中為30 h，在酵母細(xì)胞中大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，脂溶指數(shù)是增加球形蛋白的熱穩(wěn)定性的一個積極因素，該蛋白的脂溶指數(shù)是86.81、正電荷殘基數(shù)（Arg + Lys）有26個，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp + Glu）有33個。蛋白質(zhì)的種類、空間結(jié)構(gòu)及活性、功能都與肽鏈中氨基酸的種類及順序有關(guān)，該蛋白是由20種氨基酸組成，其中Ala（A）含量最高，為15.3%，其次Pro（P）和Val（V），占9.7%；親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.152，該數(shù)值為負(fù)值則說明該蛋白為親水性蛋白，反之為疏水性蛋白，疏水性氨基酸很明顯的少于親水性的氨基酸，并且親水性和疏水性都在第100-150個氨基酸區(qū)間達(dá)到最高值，所以StSRP1屬于親水性蛋白，StSRP1無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。亞細(xì)胞定位分析表明該蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且該蛋白有絲氨酸（Ser）12個、蘇氨酸（Thr）16個、絡(luò)氨酸（Tyr）6個，共34個磷酸位點(diǎn)。該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域是REF（52-266）。

2.1.3 StSRP1系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過BLAST搜索比對，StSRP1與Solanum lycopersicumstress-related protein（Accession：XM_004247384.4） 相似性達(dá)97%，與Solanum pennelliistress-related protein（Accession：XM_015231821.1）相似性達(dá)96%，與Capsicum annuumstress-related protein（Accession：XM_016710268.1） 相似性達(dá) 88%。Solanum lycopersicum、Solanum pennellii和Capsicum annuum都屬于茄科。因此，馬鈴薯StSRP1與其他茄科植物SRP具有高度保守的序列結(jié)構(gòu)。

運(yùn)用MEGA5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建20個相關(guān)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），從系統(tǒng)發(fā)生樹上節(jié)點(diǎn)位置和分支長度上分析，StSRP1與馬鈴薯、番茄同屬一支，它們可能具有共同的起源，與辣椒、煙草親緣關(guān)系次之。

2.1.4 StSRP1的二、三級結(jié)構(gòu)分析 StSRP1蛋白約含49.65%的α-螺旋、5.56%的延伸帶和44.79%的無規(guī)則卷曲（圖3-A），用CPHmodels建立StSRP1的分子模型（圖3-B），模板Template= 2R6G.G、Id=13.0、Coverage=66.0，StSRP1的二級結(jié)構(gòu)分析證實了StSRP1蛋白的三維模型是合理的。

圖2 StSRP1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.1.5StSRP1序列的啟動子分析 基于馬鈴薯基因組的公開序列，從馬鈴薯基因組DNA中獲得起始密碼子ATG上游2 000 bp 5′側(cè)翼序列。利用PlantCare在線軟件分析StSRP1啟動子序列，在StSRP1啟動子1 000 bp區(qū)域存在23種潛在的順式作用元件，并在許多位置發(fā)現(xiàn)多個核心順式作用元件，包括TATA和CAAT box。一系列假定的順式調(diào)控元件能夠使StSRP1可誘導(dǎo)或組織特異性表達(dá)，如參與脫落酸反應(yīng)順式作用元素ABRE、參與光應(yīng)答的順式作用調(diào)節(jié)元件G-box，MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)CCAAT-box、參與防御和脅迫應(yīng)答的順式作用元素TC-rich repeats。

圖3 StSRP1蛋白二級結(jié)構(gòu)（A）和三級結(jié)構(gòu)（B）

2.2 StSRP1的表達(dá)量分析

2.2.1 青枯菌誘導(dǎo)StSRP1的表達(dá)模式 為了確定在細(xì)菌侵染下StSRP1的表達(dá)情況，以及StSRP1的表達(dá)隨時間推移的變化，對接種后馬鈴薯幼苗在不同時間點(diǎn)的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分（圖4）。StSRP1受病原菌誘導(dǎo)，能在接種后快速、持續(xù)地表達(dá)。在接種24 h后，其表達(dá)水平開始顯著提高，并在接種48 h后表達(dá)量至最高水平，接種后84 h表達(dá)量迅速下降。相比對照組，StSRP1的表達(dá)量無明顯變化，一直處于較低水平的表達(dá)狀態(tài)。表明正常情況下，該基因在植物體內(nèi)維持低水平表達(dá)，以調(diào)節(jié)基本的代謝，當(dāng)受到病原菌脅迫時，表達(dá)量便會被上調(diào)，推測它與馬鈴薯抗青枯病相關(guān)免疫應(yīng)答關(guān)系密切。

2.2.2 非生物脅迫下StSRP1的表達(dá) 為探討StSRP1蛋白在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答中的作用，通過研究StSRP1在MJ和ABA激素反應(yīng)中的表達(dá)（圖5）發(fā)現(xiàn)，MJ和ABA都能夠不同程度地誘導(dǎo)StSRP1上調(diào)表達(dá)，經(jīng)MJ處理后，StSRP1的表達(dá)量在3 d時達(dá)到高峰，在5 d時表達(dá)量開始明顯下降。經(jīng)ABA處理后，StSRP1的表達(dá)量在1 d時增加后，在2 d時立即下降，然后在3 d時達(dá)到高峰。結(jié)果表明，不同激素處理誘導(dǎo)了StSRP1的表達(dá)，因此StSRP1可能在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用。

圖4 StSRP1在馬鈴薯與青枯菌互作早期時的表達(dá)分析

圖5 非生物脅迫下StSRP1的表達(dá)分析

3 討論

脅迫相關(guān)蛋白在植物響應(yīng)逆境中至關(guān)重要，調(diào)節(jié)多種真核細(xì)胞的生命活動。這已在相關(guān)研究中得到支持。Park等［16］研究表明，SRP僅在高等植物中發(fā)現(xiàn)，并且對非生物脅迫信號傳導(dǎo)非常重要。木豆種子干燥過程中，脅迫相關(guān)蛋白在保護(hù)酶和脂質(zhì)大分子中的有著重要作用［17］，在大豆中，水脅迫條件下，70 kD HSP蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［18］；在橡膠樹中SRPP和REF定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［19］；在水仙花中，SbSRP在質(zhì)膜中表達(dá)［20］，這與通過生物信息學(xué)分析SPR蛋白的亞細(xì)胞定位一致。Qi等［21］研究表明含有REF結(jié)構(gòu)域的基因參與脅迫應(yīng)答，在水仙花中，SbSRP轉(zhuǎn)錄物在鹽，干燥，熱和冷脅迫下表現(xiàn)出更高的表達(dá)［20］，關(guān)于StSRP1表達(dá)調(diào)控的研究很少。StSRP1預(yù)測的保守結(jié)構(gòu)域是REF，表明StSRP1可能參與脅迫應(yīng)答。

為了研究調(diào)節(jié)StSRP1表達(dá)的機(jī)制，選取StSRP1蛋白起始密碼子上游的2 000 bp堿基，預(yù)測其啟動子，啟動子中含有參與防御和脅迫應(yīng)答的順式作用元素TC-rich repeats，進(jìn)一步表明StSRP1可能參與脅迫應(yīng)答。植物中的脅迫適應(yīng)性應(yīng)答通常涉及ABA激活的信號通路與其他植物激素（例如MeJA，水楊酸和乙烯）之間的協(xié)同和拮抗相互作用［22］。StSRP1的側(cè)翼序列中發(fā)現(xiàn)了參與脫落酸反應(yīng)順式作用元素ABRE，它對StSRP1表達(dá)的影響沒有報道。StSRP1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的片段對于在轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育中驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能具有很大的實用性，需要進(jìn)一步的缺失分析來闡明StSRP1啟動子區(qū)的順式作用元件。顯然，用ABA、MJ和病原菌處理，StSRP1的表達(dá)量上調(diào)，為進(jìn)一步研究StSRP1功能及在青枯菌脅迫下的響應(yīng)機(jī)制提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

經(jīng)青枯菌誘導(dǎo)，克隆獲得的馬鈴薯StSRP1，全長867 bp，編碼289個氨基酸，含有REF保守結(jié)構(gòu)域，屬于REF家族，與茄科科植物番茄SRP聚為一支。StSRP1可能參與馬鈴薯激素調(diào)控和逆抗逆應(yīng)答。