陳 芬，郭凌燕，李 羽，陳林林

(南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科、江西省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，其易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差[1]。口腔疣狀癌(oral verrucous carcinoma，OVC)是鱗狀細(xì)胞癌的疣狀變異型，生長方式為局部推進(jìn)，生長緩慢，轉(zhuǎn)移發(fā)生在后期或不轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較好。OSCC與OVC呈現(xiàn)出的不同臨床和顯微病理特征反映出其不同的生物學(xué)行為和預(yù)后。

以往學(xué)者做了大量的研究,以明確參與OVC發(fā)病機制的活性分子。MOHTASHAM等[2]對p53、Ki-67、MMP-2、MMP-9進(jìn)行了組織化學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以在腫瘤侵襲前期用于鑒別OSCC和OVC。Bcl-X和細(xì)胞周期蛋白D1也被發(fā)現(xiàn)在OVC中有差異表達(dá)[3-4]。HARISHANKAR等[5]發(fā)現(xiàn)Notch4下調(diào)可作為OVC可靠的預(yù)后標(biāo)記,但是在腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究上，VALLONTHAIEL等[6]發(fā)現(xiàn)pRb、p16和p27蛋白在OSCC和OVC之間沒有明顯區(qū)別。導(dǎo)致兩者明顯不同的生物學(xué)行為的相關(guān)病理因素仍然不完全清楚。本研究基于OSCC和OVC兩者的臨床病理特征不同，比較評價血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)和血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)在OSCC和OVC中的表達(dá)，以探討OSCC和OVC不同臨床生物學(xué)特征可能的內(nèi)在原因。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2005—2013年經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷確診為口腔疣狀癌26例(OVC組，發(fā)生于下唇12例、牙齦6例、頰黏膜3例、口底2例、舌2例、磨牙后區(qū)1例)、口腔鱗狀細(xì)胞癌21例(OSCC組，發(fā)生于牙齦9例、頰黏膜8例、口底2例、舌1例、磨牙后區(qū)1例)組織標(biāo)本以及6例正?？谇谎啦垧つ?對照組)組織標(biāo)本。根據(jù)口腔癌的國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版TNM分類分期方法對病例進(jìn)行臨床分期，其中口腔疣狀癌Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期4例；口腔鱗癌Ⅰ期8例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例?？谇火酄畎o淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，口腔鱗癌的5例Ⅲ期病例均為頸淋巴轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生于口腔外其他部位的疣狀癌和鱗癌，病史不詳?shù)幕颊撸中g(shù)前接受過放療、化療或其他治療的患者。每個蠟塊行3 μm厚連續(xù)切片5張。本研究已獲得南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會同意和患者知情同意。

1.2 試劑與材料

即用型VEGF-A兔抗人多克隆抗體(4 μg·mL-1)、VEGF-C鼠抗人單克隆抗體(4 μg·mL-1)，均購自SantaCruzBiotechnology公司；快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物(KIT-5030)，DAB顯色試劑盒(DAB-0031),免疫組化防脫片劑多聚賴氨酸(GLU-0040)均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。無水乙醇、二甲苯、中性樹膠等為國產(chǎn)市售產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

蠟塊常規(guī)切片(厚3 μm)采用MaxvisionTM2/HRP法對組織切片進(jìn)行VEGF-A、VEGF-C免疫組化染色。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，選用VEGF-A和VEGF-C高表達(dá)的乳腺癌腫瘤細(xì)胞作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生采用統(tǒng)一評分標(biāo)準(zhǔn)和單盲法對所有染色結(jié)果進(jìn)行判定，評分過程均重復(fù)2次以上。觀察者事先不知道所觀察切片的任何臨床信息。

VEGF-A、VEGF-C陽性判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞陽性表達(dá)所占百分率為0%、1%～10%、11%～30%、31%～50%、51%～100%，分別計作0、1、2、3、4分；根據(jù)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的著色深淺對比，來判斷染色強度，無著色為0分、輕度著色為1分、中度著色為2分、重度著色為3分。將兩項得分相加，定為染色結(jié)果，若總分≥3，則認(rèn)為VEGF-A或VEGF-C陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-A表達(dá)比較

VEGF-A蛋白主要位于細(xì)胞漿內(nèi),陽性著色為棕黃色或棕褐色,也可見細(xì)胞膜著色,腫瘤邊緣著色更深(封三圖1A—C)。OSCC組VEGF-A表達(dá)陽性率明顯高于OVC組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 VEGF-A在3組組織中的表達(dá)比較 例

#P<0.05與OSCC組比較。

2.2 VEGF-C表達(dá)比較

VEGF-C蛋白主要位于細(xì)胞漿內(nèi),陽性著色呈棕黃色或棕褐色(封三圖1D—E)。OSCC組VEGF-C表達(dá)陽性率均明顯高于OVC組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 VEGF-C在3組組織中的表達(dá)比較 例

#P<0.05與OSCC組比較。

3 討論

口腔疣狀癌是鱗狀細(xì)胞癌的疣狀變異型，生長方式為局部推進(jìn)，生長緩慢，后期發(fā)生轉(zhuǎn)移或不轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較好。隨著對口腔疣狀癌的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)行為具有多樣性，唐瞻貴等[8]將口腔疣狀癌分為外生型、浸潤型和囊腫型，并發(fā)現(xiàn)口腔角化囊性瘤、口腔疣狀白斑和口腔扁平苔蘚可惡變發(fā)展為口腔疣狀癌。有少部分口腔疣狀癌發(fā)展迅速，甚至早期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此，研究口腔疣狀癌與口腔鱗狀細(xì)胞癌不同的發(fā)生發(fā)展機制，對臨床上口腔疣狀癌患者選擇更合適的治療手段具有重要意義。

盡管目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為VEGF-A、VEGF-C與惡性腫瘤的脈管新生關(guān)系密切，但在各類腫瘤的研究中，兩者與腫瘤局部生長、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移之間關(guān)系的研究結(jié)果還是存在著差異[9-11]。

腫瘤患者體內(nèi)存在多種血管生成刺激因子,在眾多血管生成刺激因子中，VEGF被認(rèn)為是最重要的始動因子。1989年,FERRARA等[12]首次從牛腦垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中將VEGF-A純化出來，研究證明,VEGF-A在增加微血管滲透性的同時，還能使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成新生微血管，因此，VEGF-A的表達(dá)水平可以反應(yīng)組織血管生成的能力。

與血管內(nèi)皮生長因子相結(jié)合的受體是特異性酪氨酸蛋白激酵受體(receptor tyrosine kinase,RTK)超家族,即受體VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。其中VEGFR-1、VEGFR-2位于血管內(nèi)皮表面，VEGFR-3位于淋巴管內(nèi)皮表面，VEGF-A主要與VEGFR-1、VEGFR-2相結(jié)合，作用于血管內(nèi)皮，主要誘導(dǎo)血管生成。VEGF-C與VEGFR-2、VEGFR-3相結(jié)合，但其與VEGFR-3相結(jié)合的親和力比VEGFR-2高3倍多，優(yōu)先與VEGFR-3相結(jié)合，所以VEGF-C的主要作用是誘導(dǎo)淋巴管生成[13-15]。

有研究[16-17]表明在多種腫瘤中VEGF都有高表達(dá)，如肺癌、胃癌、食道癌、喉癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌及膀胱癌。YANASE等[18]的研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，VEGF-A表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，VEGF-C與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、5年生存率相關(guān)。本研究結(jié)果表明,在口腔疣狀癌組織中VEGF-A陽性表達(dá)率為42.31%(11/26),VEGF-C陽性表達(dá)率為11.54%(3/26)；口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中VEGF-A陽性表達(dá)率為71.43%(15/21),VEGF-C陽性表達(dá)率為52.38%(11/21)；而在正?？谇火つそM織中VEGF-A低表達(dá)，陽性表達(dá)率為16.67%(1/6)，VEGF-C無表達(dá)。VEGF-A及VEGF-C在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于口腔疣狀癌組織和正常口腔黏膜組織，提示VEGF-A及VEGF-C的高表達(dá)可能是促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素，可能影響其生物學(xué)行為及其轉(zhuǎn)移潛能，導(dǎo)致口腔鱗狀細(xì)胞癌較口腔疣狀癌更易發(fā)生局部復(fù)發(fā)及區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。