陳玉梅，李璐璐，陳錦玲，徐 媛，李惠敏，秦新民

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物[1]，其含油量高達(dá)40%～60%，蛋白質(zhì)含量20%～30%[2]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前，花生在我國(guó)農(nóng)作物中的種植面積居第7位，但年產(chǎn)值居第4位[3]。我國(guó)不僅是花生生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，同時(shí)也是出口大國(guó)，出口量占世界花生市場(chǎng)貿(mào)易總量的40%。據(jù)報(bào)道，我國(guó)花生消費(fèi)中46%～48%用于榨油[4]。相關(guān)研究表明，榨油原料含油量每提高1個(gè)百分點(diǎn)，油脂加工的純利潤(rùn)可提高7%[5]。長(zhǎng)期以來，我國(guó)花生育種目標(biāo)主要是高產(chǎn)、早熟和抗逆性等[6]。但對(duì)于一個(gè)優(yōu)良的花生品種來說，高含油量是一個(gè)重要指標(biāo)，提高花生含油量可以大大增加花生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。谷建中等[7]通過對(duì)23個(gè)高油酸花生品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)開選016為適應(yīng)性廣、配合力高的優(yōu)異高油酸花生種質(zhì),具有較高的育種價(jià)值。通過分子生物學(xué)手段在轉(zhuǎn)錄水平上深入研究花生油脂合成相關(guān)基因，對(duì)提高花生油脂含量、改善花生品質(zhì)等具有重要意義。

參與植物油脂合成的3個(gè)關(guān)鍵酶分別為甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)[8]。其中，DGAT是催化三酰甘油(TAG)合成的最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶，在油脂合成過程中起著重要作用[9]。目前，在微藻[10]、油茶[11-12]、油棕[13]、油桐[14]、核桃[15]和白檀[16]等多種油料植物研究中已經(jīng)證實(shí)，參與油脂合成的相關(guān)基因和酶對(duì)于種子油脂合成具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，關(guān)于花生油脂合成方面的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。華方靜[17]發(fā)現(xiàn)，同一花生品種的不同發(fā)育時(shí)期，Ah-GPAT9基因的表達(dá)量差異極顯著，種子含油量與該基因表達(dá)量呈正相關(guān)，并且表達(dá)峰值高或峰值持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)均有利于油脂合成。陳四龍等[18]通過構(gòu)建花生cDNA文庫和EST測(cè)序發(fā)現(xiàn)，AhLPAT基因的表達(dá)量與油脂的積累速率變化一致，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)驗(yàn)證，成功轉(zhuǎn)化該基因的擬南芥植株,其種子含油量顯著增加，說明該基因?qū)ΨN子的油脂合成起到正向調(diào)控作用。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，GPAT、LPAAT、DGAT等3類?；D(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)總量與花生和甘藍(lán)型油菜的籽仁含油量呈顯著或極顯著正相關(guān)[19-20]。并且，DGAT基因能夠使釀酒酵母TAG合成缺陷株恢復(fù)TAG的合成與積累[21]。和小燕等[22]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Ω哂秃偷陀?個(gè)花生品種進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有四大類代謝的484條基因與油脂代謝相關(guān)。目前，關(guān)于花生油脂合成相關(guān)基因的研究大多是對(duì)關(guān)鍵基因的單獨(dú)研究，對(duì)花生油脂合成的整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究尚不深入，鑒于此，對(duì)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選與油脂合成相關(guān)的差異表達(dá)基因以及轉(zhuǎn)錄因子等，為進(jìn)一步了解花生油脂合成相關(guān)基因的調(diào)控模式及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為高油花生品種的培育提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為花生(ArachishypogaeaL.)品種桂花37，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在花生盛花期，每天對(duì)當(dāng)天盛開的花朵進(jìn)行掛牌標(biāo)記。選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無病蟲害的花生植株，分別取花后20、35、50、60 d (分別為籽粒發(fā)育的前期、中期、成熟期、成熟后期)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花生莢果，剝?nèi)セㄉ鷼ず笱杆賹⒆蚜?分別以HS20、HS35、HS50、HS60表示)放入液氮中速凍20 min，再轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存，作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的材料。

1.2.2 花生籽?？俁NA的提取、建庫以及測(cè)序 提取4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽?？俁NA，對(duì)檢測(cè)合格的RNA樣品進(jìn)行建庫和高通量測(cè)序，建庫和測(cè)序方法參考文獻(xiàn)[23]。

1.2.3 差異表達(dá)基因的篩選 對(duì)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將得到的數(shù)據(jù)按發(fā)育時(shí)期的先后順序進(jìn)行兩兩比對(duì)，即分為HS20-vs-HS35、HS35-vs-HS50和HS50-vs-HS60 3個(gè)比較組，旨在分析出在4個(gè)時(shí)期中都有的差異表達(dá)基因，再進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋。對(duì)表達(dá)量的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并進(jìn)行泊松分布計(jì)算，對(duì)差異檢驗(yàn)的P值作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，減少假陽性。差異表達(dá)基因設(shè)定為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上，同時(shí)校正P值<0.05。

1.2.4 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分類以及富集分析 根據(jù)差異表達(dá)基因篩選結(jié)果進(jìn)行GO(Gene ontology)功能分類，主要包括分子功能、細(xì)胞組分和生物過程三大功能類。使用R軟件的Phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析，計(jì)算P值，并進(jìn)行FDR校正，F(xiàn)DR≤0.01視為顯著富集。

1.2.5 差異表達(dá)基因的KEGG Pathway分類和富集分析 對(duì)差異基因進(jìn)行生物通路分類，使用R軟件中Phyer函數(shù)進(jìn)行富集分析，得到顯著富集的通路，對(duì)P值進(jìn)行FDR校正，F(xiàn)DR≤0.01視為顯著富集。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄因子家族分析 轉(zhuǎn)錄因子是一類能與5′端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定強(qiáng)度在特定時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。通過getorf檢測(cè)Unigene的ORF，然后通過hmmsearch檢索，比對(duì)出轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，根據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(PlantTDB)描述的轉(zhuǎn)錄因子家族特征對(duì)Unigene進(jìn)行功能鑒定。

1.2.7 差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證 通過Tri-zol法提取花生籽粒4個(gè)時(shí)期的總RNA，采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，利用Analytikjena-qTOWER 2.2型熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，各個(gè)樣品中目的基因相對(duì)表達(dá)量通過qPCRsoft 3.2軟件的Pfaffl method公式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒總RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽粒樣品HS20、HS35、HS50、HS60提取總RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明，各樣品的總RNA樣品OD260/280在2.04～2.90，RIN/RQN值在9.1～9.4，其完整性高，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒轉(zhuǎn)錄組文庫測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

對(duì)花生籽粒樣品HS20、HS35、HS50、HS60進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)經(jīng)數(shù)據(jù)過濾，除去低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量大于5%的Reads，得到過濾后數(shù)據(jù)(Clean reads)。各個(gè)時(shí)期所得到的Clean reads占原始數(shù)據(jù)的94%以上，其中Q20高達(dá)97%以上，Q30高達(dá)90%以上，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高(表1)，可進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Sequencing date statistics

2.3 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒差異表達(dá)基因的篩選

根據(jù)不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒樣品基因表達(dá)水平，檢測(cè)顯著差異表達(dá)基因，結(jié)果如圖1所示。在HS20-vs-HS35中，差異表達(dá)基因總數(shù)為25 769個(gè)，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因有3 235個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)基因有22 534個(gè)；HS35-vs-HS50中，差異表達(dá)基因總數(shù)為18 403個(gè)，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因有11 579個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)基因有6 824個(gè)；HS50-vs-HS60中，差異表達(dá)基因總數(shù)為12 308個(gè)，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因有3 235個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)基因有9 073個(gè)。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 The volcano plot of differential expression genes of the different developmental stages in peanut seed

2.4 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析

2.4.1 GO功能分類 HS20-vs-HS35、HS35-vs-HS50、HS50-vs-HS60差異表達(dá)基因的GO功能分類結(jié)果如圖2—4所示，在HS20-vs-HS35的差異表達(dá)基因中，參與分子功能(Molecular function)、細(xì)胞組分(Cellular component)、生物過程(Biological process)的基因分別有15 649、22 489、18 913個(gè)；在HS35-vs-HS50中，分別有11 445、16 336、13 383個(gè)；在HS50-vs-HS60中，分別有7 782、10 741、9 216個(gè)。

圖2 HS20-vs-H35差異表達(dá)基因GO分類圖Fig.2 GO classification map of differential expression genes of HS20-vs-H35

2.4.2 GO功能富集分析 對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽粒的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，HS20-vs-HS35的差異表達(dá)基因被富集到5 790個(gè)GO 條目中，其中，參與生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的差異表達(dá)基因含義不同分別占56.98%、12.31%、30.71%；HS35-vs-HS50的差異表達(dá)基因被富集到5 301個(gè)GO 條目中，參與生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的差異表達(dá)基因含義不同分別占56.97%、11.94%、31.09%；HS50-vs-HS60的差異表達(dá)基因被富集到4 826個(gè)GO 條目中，參與生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的差異表達(dá)基因分別占57.44%、12.20%、30.36%。通過分析各組分占比可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)比較組中大多數(shù)差異表達(dá)基因參與生物過程，其次是分子功能，最后是細(xì)胞組分。3個(gè)比較組中差異表達(dá)基因最顯著的20個(gè)GO富集功能如圖5—7所示。

圖3 HS35-vs-HS50差異表達(dá)基因GO分類圖Fig.3 GO classification map of differential expression genes of HS35-vs-HS50

2.5 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒差異表達(dá)基因的KEGG Pathway富集分析

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，將所有的差異表達(dá)基因分為135類代謝通路，HS20-vs-HS35、HS35-vs-HS50、HS50-vs-HS60的代謝通路以及差異基因數(shù)量如表2所示。結(jié)果表明，在代謝通路中，參與花生油脂代謝的通路主要有脂肪酸生物合成(ko00061)、不飽和脂肪酸的生物合成(ko01040)、脂肪酸延長(zhǎng)(ko00062)、脂肪酸代謝(ko01212)、花生四烯酸代謝(ko00590)等。其中，在HS20-vs-HS35、HS35-vs-HS50和HS50-vs-HS60 3個(gè)比較組中，參與脂肪酸生物合成的差異表達(dá)基因分別有63、63、43個(gè)；參與不飽和脂肪酸生物合成的分別有45、38、24個(gè)；參與脂肪酸延長(zhǎng)的分別有78、54、31個(gè)；參與脂肪酸代謝的分別有113、98、67個(gè)；參與花生四烯酸代謝的分別有57、56、34個(gè)。

2.6 基因轉(zhuǎn)錄因子家族分類

對(duì)具有編碼轉(zhuǎn)錄因子能力的基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)基因所屬的轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行分類，結(jié)果如表3所示。由表3可見，可能參與油脂合成的轉(zhuǎn)錄因子有ABI3VP1家族、AP2-EREBP家族以及C2C2-Dof家族的成員，其中,屬于ABI3VP1家族的轉(zhuǎn)錄因子有154個(gè)、屬于AP2-EREBP家族的轉(zhuǎn)錄因子有236個(gè)， 屬于C2C2-Dof家族的轉(zhuǎn)錄因子有66個(gè)。

圖4 HS50-vs-HS60差異表達(dá)基因GO分類圖Fig.4 GO classification map of differential expression genes of HS50-vs-HS60

圖5 HS20-vs-HS35差異表達(dá)基因GO富集圖 Fig.5 GO enrichment map of differential expression genes of HS20-vs-HS35

圖6 HS35-vs-HS50差異表達(dá)基因GO富集圖 Fig.6 GO enrichment map of differential expression genes of HS35-vs-HS50

圖7 HS50-vs-HS60差異表達(dá)基因GO富集圖 Fig.7 GO enrichment map of differential expression genes of HS50-vs-HS60

表2 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒代謝通路及其差異表達(dá)基因數(shù)量Tab.2 The metabolic pathways and the number of differential expression genes of the different developmental stages in peanut seed

續(xù)表2 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒代謝通路及其差異表達(dá)基因數(shù)量Tab.2(Continued) The metabolic pathways and the number of differential expression genes of the different developmental stages in peanut seed

續(xù)表2 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒代謝通路及其差異表達(dá)基因數(shù)量Tab.2(Continued) The metabolic pathways and the number of differential expression genes of the different developmental stages in peanut seed

續(xù)表2 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒代謝通路及其差異表達(dá)基因數(shù)量Tab.2(Continued) The metabolic pathways and the number of differential expression genes of the different developmental stages in peanut seed

表3 基因所屬轉(zhuǎn)錄因子家族的分類Tab.3 Classification of transcription factor families of genes

2.7 不同發(fā)育時(shí)期花生籽粒差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)量的準(zhǔn)確性，以18SRNA為內(nèi)參基因，選取轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的4個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，4個(gè)差異表達(dá)基因和內(nèi)參基因的引物如表4所示。由圖8可見，RT-PCR驗(yàn)證的基因表達(dá)量變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(表5)中基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得到的數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。

表4 RT-PCR驗(yàn)證的差異表達(dá)基因及其引物Tab.4 The differential expression genes and primers of RT-PCR validation

圖8 差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.8 The RT-PCR validation results of the differential expression genes

表5 4個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因的表達(dá)量Tab.5 The expression of four genes sequenced by transcriptome

3 結(jié)論與討論

植物種子中的油脂主要以三酰甘油的形式儲(chǔ)存，其積累呈慢—快—慢的變化規(guī)律[24-25]。脂肪酸是油脂的重要組成部分，本研究中發(fā)現(xiàn)，花生不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因涉及脂肪酸合成的代謝途徑主要有脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延長(zhǎng)、脂肪酸代謝、花生四烯酸代謝等幾種代謝通路。HS20-vs-HS35、HS35-vs-HS50、HS50-vs-HS60參與脂肪酸生物合成的差異表達(dá)基因分別有63、63、43個(gè)，參與不飽和脂肪酸生物合成的分別有45、38、24個(gè)，參與脂肪酸延長(zhǎng)的分別有78、54、31個(gè)，參與脂肪酸代謝的分別有113、98、67個(gè)，參與花生四烯酸代謝的分別有57、56、34個(gè)。這些基因的表達(dá)呈現(xiàn)出慢—快—慢的趨勢(shì)。如參與脂肪酸合成代謝的基因fabG在花后20、35、50、60 d時(shí)的表達(dá)量(Reads per kb per million reads，F(xiàn)PKM)分別為3.67、551.79、1 960.28、2 100.08。參與亞油酸代謝途徑的基因LOX1_5的表達(dá)量分別為3.05、53.18、1 096.15、1 268.16，脂肪酸代謝中的FAD2基因表達(dá)量分別為23.68、153.80、226.88、268.06。另外，參與油脂合成的相關(guān)基因和酶中，催化三酰甘油合成的最后一步反應(yīng)的DGAT基因有79個(gè)。其他參與油脂合成的酶，如?；鵄CP 硫酯酶(Acyl-ACP thioesterase)基因有11個(gè)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase)基因有23個(gè)，β-酮脂酰-ACP 合酶(β-ketoacyl-ACP synthase)基因有3個(gè)，β-酮脂酰-ACP 還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase)基因有2個(gè)。

相關(guān)研究表明，多種轉(zhuǎn)錄因子在種子油脂合成過程中起調(diào)控作用[26]。ABI3、FUS3和LEC2轉(zhuǎn)錄因子在油脂合成和種子成熟過程中相互調(diào)節(jié)，其中，ABI3主要參與蛋白質(zhì)含量的調(diào)節(jié)，F(xiàn)US3主要調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成。另外，LEC2和FUS3在種子胚的不同發(fā)育階段發(fā)揮作用[27]。WRI1(WRINKLED1)轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP家族的一員。擬南芥中過表達(dá)WRI1可以上調(diào)脂肪酸合成的一組基因，包括丙酮酸激酶、乙酰輔酶A羧化酶、?；d體蛋白和酮脂酰ACP合成酶等基因[28]。玉米中過表達(dá)ZmLEC1轉(zhuǎn)錄因子可以提高含油量[29]。Dof(DNA binding with one finger)是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，N末端含有一個(gè)高度保守的C2-C2單鋅指結(jié)構(gòu)，能夠特異識(shí)別啟動(dòng)子序列中的AAAG/CTTT元件，從而調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)[30]。相關(guān)研究表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控脂肪酸的合成[31]。大豆中已有28個(gè)Dof基因被鑒定參與油脂合成調(diào)控，過表達(dá)GmDof4和GmDof11基因可以提高乙酰輔酶A羧化酶和長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A合成酶基因的表達(dá)，同時(shí)GmDof4和GmDof11基因轉(zhuǎn)化擬南芥植株的種子中，總脂肪酸和脂質(zhì)含量都有所增加[32]。本研究中，與油脂合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有ABI3VP1、AP2-EREBP、C2C2-Dof家族的成員，分別有154、236、66個(gè)。

本研究中，HS20-vs-HS35、HS35-vs-HS50和HS50-vs-HS60的差異表達(dá)基因總數(shù)分別是25 769個(gè)、18 403個(gè)和12 308個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因分別占12.55%、62.92%和26.28%。 從上述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在花生籽粒油脂合成前期，下調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量(22 534)所占比例大，籽粒油脂積累緩慢；隨著籽粒的不斷生長(zhǎng)，上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量(11 579)所占比例上升，多于下調(diào)差異表達(dá)基因，有利于促進(jìn)籽粒中油脂的迅速積累；而到了油脂合成后期，下調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量(9 073)所占比例較大，又多于上調(diào)差異表達(dá)基因，導(dǎo)致了籽粒中油脂合成速度變慢。以上數(shù)據(jù)表明，花生油脂的積累是個(gè)非常復(fù)雜的過程，受到許多基因和轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)節(jié)，構(gòu)成了一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其主要功能基因及其在油脂合成與積累過程的相互關(guān)系尚有待深入研究。