李忠邦，閻 萍

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

哺乳動物的精子發(fā)生過程由多個因素同時調(diào)控，而遺傳因素在其中起著決定性作用。許多與精子發(fā)生相關(guān)的基因，包括睪丸特異性基因和睪丸高表達基因的突變、缺失、功能異常最終都會導(dǎo)致雄性不育[1]。SCHLECHT等[2]利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，約200個基因在大鼠生殖細(xì)胞的發(fā)育中起著調(diào)節(jié)作用。國外研究者于20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)了一種特別的殺菌劑——溶菌酶，基于其物理和功能特性，已經(jīng)鑒定出多種溶菌酶，它們主要分為6個家族：g型(鵝型)、c型(雞型)、無脊椎動物型(i型)、噬菌體型、細(xì)菌型和植物型[3]。其中，c型(雞型)溶菌酶存在于多個物種的雄性生殖道內(nèi)以及不同器官組織中。c型溶菌酶是N-乙酰葡糖胺結(jié)合蛋白，包括2種類型，即非鈣結(jié)合c-溶菌酶和鈣結(jié)合c-溶菌酶[4]。人溶菌酶(Human lysozyme，LYZ)屬于c型溶菌酶家族，c型溶菌酶家族還包括其他5種人源類溶菌酶蛋白(Human lysozyme-like protein，LYZL)[5]。初步研究表明，LYZL主要存在于雄性生殖系統(tǒng)，定位于睪丸、附睪和精子上[6-7]。目前，已經(jīng)從人類的雄性生殖道中克隆出編碼4種c型LYZL的基因(LYZL2、LYZL4、LYZL6和SPACA3)。其中，LYZL4基因能夠在人類精子的后頂體區(qū)域高度富集，也能夠在小鼠的睪丸、附睪和精子中表達。小鼠的LYZL4及其特異性抗體的免疫中和作用顯著降低了小鼠體外受精的比例，并呈劑量依賴性[8]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，rLYZL6蛋白能夠在生理pH條件下對革蘭氏陽性細(xì)菌顯示出弱的溶菌活性[9]，而LYZL6能夠定位于成熟精子的頂體后區(qū)和中段之前[10]。由于LYZL6也是c型溶菌酶家族的成員，為了了解其是否表現(xiàn)出對糖基鍵的溶菌活性，在菌落形成中通過測試重組LYZL6蛋白殺死菌株S.au ATCC25923的能力，進一步明確了它的溶菌活性，而這種活性可能是由于LYZL6中存在2個保守的必需催化殘基35-Glu和52-Asp[3]。

牦牛是生活于高寒、高海拔地區(qū)的特有牛種，是我國及世界珍稀的物種資源，但其具有繁殖能力低的劣勢。因此，了解牦牛在發(fā)育過程中的生殖調(diào)控，對保護這一珍貴的物種資源具有重要意義。本研究選取性成熟前6月齡和18月齡、性成熟早期30月齡以及性成熟后72月齡4個不同時期的牦牛，通過對其LYZL4和LYZL6的基因及蛋白質(zhì)表達機制進行研究，了解LYZL4和LYZL6在牦牛睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中的調(diào)控機制，旨在為牦牛繁殖性能研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 熒光定量試驗主要儀器與試劑 Trizol Reagent購自Invitrogen(美國)公司，SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒、Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa(大連)公司，其他無特殊說明的試劑均為國產(chǎn)分析純；熒光定量PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Biodine Rad公司。

1.1.2 Western-blot和免疫組織化學(xué)試驗主要試劑 全蛋白提取試劑盒購自北京Solarbio公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL Plus超敏化學(xué)發(fā)光液均購自蘇州新賽美生物科技有限公司；生物素化二抗Goat Anti-rabbit IgG/HRP、一抗均購于Bioss生物公司；檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH值6.0)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊血清購自北京中山金橋生物有限公司；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 牦牛睪丸組織樣本采集

選取健康狀況良好的6、18、30、72月齡牦牛公畜各3頭。每組牦牛個體營養(yǎng)狀況相同、體質(zhì)量相似。牦牛經(jīng)過放血致死后，取一部分睪丸組織裝入凍存管投入液氮帶回，分樣后置于-80 ℃保存，剩余部分組織樣品裝入含有4%多聚甲醛的離心管中進行固定。

1.3 試驗方法

1.3.1 牦牛睪丸組織總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 常規(guī)Trizol法提取牦牛睪丸組織樣品的總RNA，應(yīng)用核酸分析儀檢測總RNA質(zhì)量濃度以及OD值，模板RNA選用OD值在1.8～2.0的總RNA，按照Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA，以GAPDH基因的特異性引物檢測合成的cDNA。

1.3.2 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI已報道的LYZL4基因(登錄號：NM_001077959.1)、LYZL6基因(登錄號：NM_001046466.1)和GAPDH基因(登錄號：NM_001034034.2)序列，使用Primer 5.0分別設(shè)計引物，然后由NCBI中的BLAST檢測引物特異性。設(shè)計的引物由西安擎科生物工程有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 qRT-PCR引物序列信息Tab.1 qRT-PCR primer sequence information

1.3.3 qRT-PCR檢測牦牛睪丸組織LYZL4、LYZL6基因的表達 按照SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒建議的qRT-PCR反應(yīng)體系，以GAPDH基因作為內(nèi)參進行qRT-PCR反應(yīng)，每個樣本進行3次重復(fù)，用2-ΔΔCt法對定量結(jié)果進行分析。

1.3.4 Western-blot檢測牦牛睪丸組織LYZL4、LYZL6蛋白的表達 根據(jù)全蛋白提取試劑盒所提供的步驟提取牦牛睪丸組織樣品的全蛋白，利用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測全蛋白濃度。然后在得到的全蛋白樣品中加入上樣緩沖液，置于沸水中使蛋白質(zhì)變性后，上樣并進行電泳，結(jié)束電泳后轉(zhuǎn)膜并封閉，分別加入一抗和二抗后于4 ℃孵育過夜。最后加入適量配制好的ECL Plus超敏化學(xué)發(fā)光液，在暗室中依次經(jīng)顯影、水洗、定影進行膠片曝光。結(jié)果使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件掃描測定。

1.3.5 牦牛睪丸組織免疫組織化學(xué)染色 固定的牦牛睪丸組織經(jīng)全自動脫水機脫水后，進行包埋與切片，然后將脫蠟后的切片放入染色缸，浸入0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH值6.0)進行抗原修復(fù)，滴加山羊血清封閉液，然后再滴加一抗和生物素化二抗Goat Anti-rabbit IgG/HRP進行孵育，使用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行顯色，最后使用蘇木素進行輕度復(fù)染，經(jīng)脫水、透明后，使用中性樹膠封片。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定所采集全部圖像的光密度和面積。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對平均數(shù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同月齡牦牛睪丸組織中LYZL4、LYZL6基因的表達

以GAPDH為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR對不同月齡牦牛睪丸組織中LYZL4和LYZL6基因的表達進行校正之后，結(jié)果如圖1所示，LYZL4和LYZL6基因在72月齡牦牛睪丸組織中的表達量最高，在6月齡牦牛睪丸組織中的表達量最低；72月齡牦牛睪丸組織中的LYZL4和LYZL6基因表達量與6、18、30月齡存在極顯著差異(P<0.01)，30月齡牦牛睪丸組織中的LYZL4和LYZL6基因表達量與6、18月齡存在極顯著差異(P<0.01)，18月齡牦牛睪丸組織中的LYZL4和LYZL6基因表達量與6月齡也存在極顯著差異(P<0.01)。

2.2 不同月齡牦牛睪丸組織中LYZL4、LYZL6蛋白的表達

如圖2所示，在不同月齡牦牛睪丸組織中LYZL4蛋白均有表達。其中，6、18月齡牦牛睪丸組織中LYZL4蛋白的表達量偏低，而30、72月齡牦牛睪丸組織中LYZL4蛋白的表達量明顯上調(diào)，與6、18月齡牦牛相比差異極顯著(P<0.01)。牦牛睪丸組織中LYZL6蛋白表達量檢測結(jié)果如圖3所示，LYZL6蛋白在6、18月齡牦牛睪丸組織中的表達量較低，而在30、72月齡牦牛睪丸組織中的表達量極顯著上調(diào)(P<0.01)。此外，除LYZL6蛋白在18月齡牦牛睪丸組織中的表達量與6月齡相比呈下降趨勢外，不同月齡牦牛睪丸組織中LYZL6蛋白的表達趨勢與其mRNA的表達趨勢相似。

A：LYZL4 mRNA的相對表達量；B：LYZL6 mRNA的相對表達量。不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)，圖2、圖3同

A：LYZL4蛋白的Western-blot檢測結(jié)果；B：LYZL4蛋白的相對表達量

A：LYZL6蛋白的Western-blot檢測結(jié)果；B：LYZL6蛋白的相對表達量

2.3 不同月齡牦牛睪丸組織中LYZL4、LYZL6蛋白的定位

經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)，LYZL4蛋白在6月齡牦牛睪丸組織中定位于間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)(圖4A)，在18月齡牦牛的睪丸組織中主要定位于精原細(xì)胞和支持細(xì)胞內(nèi)(圖4B)，在30、72月齡的牦牛睪丸組織中定位于圓形精子細(xì)胞(圖4C和4D)；從LYZL4蛋白積分光密度值結(jié)果可以看出，18、30、72月齡的牦牛睪丸組織中LYZL4蛋白的免疫陽性信號強度顯著高于6月齡(P<0.05)，而18、30、72月齡牦牛睪丸組織中的LYZL4蛋白之間免疫陽性信號強度無明顯差異(P>0.05)(圖4E)。LYZL6蛋白在6月齡的牦牛睪丸組織中定位于間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)(圖5A)，在18月齡的牦牛睪丸組織中主要定位于精原細(xì)胞(圖5B)，在30、72月齡的牦牛睪丸組織中定位于圓形精子細(xì)胞和初級精母細(xì)胞(圖5C和5D)；從LYZL6蛋白積分光密度值結(jié)果可以看出，6月齡的牦牛睪丸組織中LYZL6蛋白免疫陽性信號強度顯著低于18、30、72月齡(P<0.05)，但是在18、30、72月齡牦牛睪丸組織中的LYZL6蛋白之間免疫陽性信號強度無顯著差異(P>0.05)(圖5E)。

A—D：6、18、30、72月齡牦牛睪丸組織；E：LYZL4蛋白積分光密度值。SC：支持細(xì)胞；LC：間質(zhì)細(xì)胞；S：精原細(xì)胞；PS：初級精母細(xì)胞；Sp：圓形精子細(xì)胞。不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖5同

A—D：6、18、30、72月齡牦牛的睪丸組織；E：LYZL6蛋白積

3 結(jié)論與討論

精液質(zhì)量是衡量動物受精能力的重要指標(biāo)，它能夠直接影響雌性動物的受孕率。因此，提高動物的精液品質(zhì)能夠進一步優(yōu)化動物的繁殖性能[11]。精子發(fā)生是一個高度復(fù)雜的過程，包括生殖細(xì)胞分化的3個主要連續(xù)階段：精原細(xì)胞的有絲分裂增殖、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變態(tài)過程[12]。在哺乳動物中，生精細(xì)胞向精子的分化過程涉及與外在因素和內(nèi)在因素相關(guān)的調(diào)節(jié)基因的順序表達[13]。在精子發(fā)生的任何階段發(fā)生失調(diào)，都可能最終導(dǎo)致不育的發(fā)生[14-16]。近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，在動物睪丸中對精子發(fā)生的調(diào)控機制及其相關(guān)基因和蛋白質(zhì)分子水平上的探索，受到越來越多的關(guān)注[17]。LYZL屬于c型溶菌酶類，但在包括大鼠在內(nèi)的許多物種中關(guān)于LYZL的研究并不多。LYZL4基因能夠編碼1條包含146個氨基酸殘基的肽鏈，成熟分子的分子質(zhì)量約14 500 u，分子中存在8個保守的半胱氨酸殘基[18]。黃鵬等[19]通過原核表達的rLYZL4制備出該蛋白質(zhì)的多克隆抗體，確認(rèn)了其在睪丸和附睪中表達，并且發(fā)現(xiàn)其定位于圓形精子細(xì)胞及長形精子細(xì)胞的頂體上。據(jù)報道，人類精子類溶菌酶蛋白1(SLLP1)和小鼠LYZL4有助于受精，但它們沒有表現(xiàn)出溶菌活性[9]。黃鵬等[20]研究證實，鵝型溶菌酶2(LysG2)主要在睪丸的支持細(xì)胞中表達并被分泌到精漿中，表明LysG2可能在雄性生殖道的先天免疫中起作用，此外，還首次報道了LYZL6是一種具有酸性和溶菌性的人類精子相關(guān)蛋白質(zhì)，并推測其可能與受精具有重要關(guān)系，但不適用于雄性生殖道的先天免疫。WEI等[6]通過免疫檢測發(fā)現(xiàn)，LYZL6蛋白存在于初級精母細(xì)胞和睪丸圓形精子細(xì)胞中以及成熟附睪精子的頂體后區(qū)域和中段，且rLYZL6蛋白具有抗菌活性。

本研究應(yīng)用qRT-PCR、Western-blot和免疫組化技術(shù)分別分析了LYZL4和LYZL6在不同月齡牦牛睪丸中的表達與定位。結(jié)果表明，LYZL4基因的表達主要集中在性成熟期間，但在未成年牦牛睪丸組織中也有表達，其表達量隨著牦牛年齡的增長而上調(diào)，LYZL4基因在性成熟前的表達量極顯著低于性成熟后(P<0.01)；LYZL4蛋白表達量在牦牛性成熟期間相對較高，主要定位于牦牛睪丸組織的圓形精子細(xì)胞中。LYZL6基因的表達主要集中在成年牦牛的睪丸組織中，而性成熟前牦牛睪丸中LYZL6基因的表達量相對較低；性成熟后LYZL6蛋白定位于初級精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞中以及成熟附睪精子的頂體前區(qū)和中段，性成熟后LYZL6蛋白的表達量極顯著高于性成熟前(P<0.01)。因此，LYZL6通過參與調(diào)控初級精母細(xì)胞的分裂而影響精子的形成過程，在哺乳動物的精卵結(jié)合過程中起著重要作用?？梢酝茰yLYZL4和LYZL6對牦牛睪丸中生精細(xì)胞的分裂過程尤其是減數(shù)分裂過程起調(diào)控作用，進而促進精子的發(fā)生，能夠保證良好的精液品質(zhì)，提高牦牛的繁殖性能。本研究為進一步研究和探討LYZL4和LYZL6基因在牦牛睪丸組織中的生物學(xué)功能提供了研究素材，但由于LYZL4和LYZL6基因的具體功能尚不清楚，并且精子發(fā)生過程的調(diào)控機制比較復(fù)雜，受到多種因素的聯(lián)合調(diào)控，因此，LYZL4和LYZL6對精子發(fā)生的具體調(diào)控作用還有待進一步研究和驗證。