朱 琳 陳 韜 徐大琴 寧 琴

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科 (湖北 武漢， 430033)

乙型肝炎病毒(HBV)所致的慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)起病兇險(xiǎn)，病情進(jìn)展極為迅速，是臨床上最為嚴(yán)重、預(yù)后不良的疾病之一。目前，HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，但公認(rèn)為系免疫介導(dǎo)的肝損傷，尤其是病毒特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)在HBV-ACLF發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1, 2]。目前認(rèn)為參與HBV-ACLF致病機(jī)制的多種因素，均直接或者間接調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致乙型肝炎重癥化[3]。我們?cè)谑?型肝炎病毒(MHV-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎模型中發(fā)現(xiàn)，病毒感染后肝臟淋巴細(xì)胞上KCNJ15表達(dá)顯著增強(qiáng)，以CD4+T和CD8+T細(xì)胞最為顯著[4]。為了進(jìn)一步研究KCNJ15基因在HBV感染誘導(dǎo)的肝衰竭肝損傷中的作用及其機(jī)制，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建人KCNJ15表達(dá)質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)染技術(shù)使Jurkat細(xì)胞過(guò)表達(dá)KCNJ15，檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的功能變化，初步探討KCNJ15在HBV-ACLF肝損傷中的可能作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 Jurkat細(xì)胞購(gòu)于武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心(ATCC?TIB-152TM、Clone E6-1);1640培養(yǎng)基、胎牛血清、購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Trizol Reagent購(gòu)于上海英駿生物技術(shù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及BamHⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Ex Taq酶購(gòu)于大連寶生物公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于Omega公司;SYBR Green購(gòu)于TOYOBO公司;鼠抗人KCNJ15抗體購(gòu)于Sigma公司;抗β-actin抗體購(gòu)于Fermantas公司;電轉(zhuǎn)染試劑盒(Lonza，VCA-1003)、電轉(zhuǎn)儀(Nucleofector I Device)訂購(gòu)于武漢安特捷生物公司;檢測(cè)Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit訂購(gòu)于BD Biosciences公司；Human Soluble Protein Master Buffer Kit及Human IL-9 Flex Set購(gòu)于BD Biosciences公司;流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)(CBA)模板及其分析軟件來(lái)源于BD Biosciences公司;Fluo-3AM購(gòu)于Calbiochem公司；鈣離子載體A23187購(gòu)于Serva公司。

1.2 引物、載體和菌株 人KCNJ15擴(kuò)增引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：F:5′-TGCGGAGTGAGTGACCAG-3′，R：5′-TGTTTGAAGGGAGTTCTG-3′。pMD-18T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)菌購(gòu)于大連寶生物公司;pcDNA3.1(+)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；DNA測(cè)序由華大基因公司(武漢)完成。

1.3 人KCNJ15表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以NCBI中KCNJ15基因變異體1編碼區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)加入酶切位點(diǎn)BamHⅠ、HindⅢ的引物，擴(kuò)增基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列。從人PBMC的cDNA 中克隆 KCNJ15基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠、進(jìn)行純化。純化后產(chǎn)物與 PMD-18T克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。擴(kuò)增后測(cè)序鑒定含有目的片段的樣本。對(duì)測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆提取質(zhì)粒后行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切處理，回收并純化，連入 pcDNA3.1(+) 表達(dá)載體。取測(cè)序正確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒備用。

1.4 Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染細(xì)胞前2天，按1∶5～1∶6的比例傳代細(xì)胞，以保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。轉(zhuǎn)染前，在12孔板中加入1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)平衡。取Jurkat細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液，900 rpm離心5min后計(jì)數(shù)。分別取出1×106細(xì)胞懸液，離心、吸出上清液，將其中兩管分別加入電轉(zhuǎn)液(solution V 82 μl和supplementⅠ18 μl)100 μl，重懸細(xì)胞，各加入不含內(nèi)毒素的pcDNA3.1(+) 2 μg和pcDNA3.1(+)-hKCNJ15質(zhì)粒 2 μg，吹打混勻。分別將上述液體轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，置于電轉(zhuǎn)儀上，選擇程序X-05(for high expression level)行電轉(zhuǎn)染。室溫下靜置10 min，取出預(yù)平衡的12孔板，分別取出培養(yǎng)基400 μl，加入到電轉(zhuǎn)杯中。然后，吸出轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至預(yù)平衡的培養(yǎng)基1 ml中。加入PcDNA 3.1(+)的Jurkat細(xì)胞稱為對(duì)照組，加入PcDNA3.1(+)-hKCNJ15質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞稱為實(shí)驗(yàn)組。在空白細(xì)胞組，先用預(yù)平衡的培養(yǎng)基500 μl重懸，加入到另一個(gè)預(yù)平衡的培養(yǎng)基1 ml。將12孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取上清液，放置于-80℃冰箱凍存用于細(xì)胞因子檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用Trizol處理提取RNA或制備蛋白樣本用于PCR或Western Blotting檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 使用CBA試劑盒檢測(cè)，先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋。振蕩Th1/Th2/Th17試劑盒內(nèi)的微珠3～5 sec，取適量至空的流式管中并振蕩混勻。取標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，將稀釋液加入裝有微珠混合物的流式管中，吹打混勻。取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清液(實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白細(xì)胞組)50 μl，加入裝有微珠混合物的流式管中，吹打混勻。分別加入試劑盒內(nèi)熒光素標(biāo)記的檢測(cè)試劑50 μl，吹打混勻。室溫避光孵育3 h。清洗后，離心、棄上清液，加入清洗液300 μl，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將CBA檢測(cè)模板導(dǎo)入流式細(xì)胞儀后，調(diào)節(jié)FSC、SSC、及各檢測(cè)通道-參數(shù)。從試劑盒中取出setup管，按操作流程上機(jī)檢測(cè)。按照模板上的提示，調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，上機(jī)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)管及各待測(cè)樣品管，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，在CBA分析軟件上進(jìn)行分析。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) KCNJ15在Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h收集細(xì)胞，用 Trizol裂解，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。引物序列如下: R：5’-AGGAAGATGGCATGAGGA-3’；F：5’-ACTTAGAACCCGGTGAGC-3’。PCR反應(yīng)體系為 20 μl，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，58℃退火10 s，72℃延伸10 s，主循環(huán)35個(gè)，72℃終延伸10 min。每一個(gè)樣本均設(shè)置GAPDH基因作為內(nèi)參，并設(shè)置副孔。

1.7 Western blotting檢測(cè) 在Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h收集細(xì)胞，制備蛋白樣品。將實(shí)驗(yàn)各組蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印PVDF膜，洗膜后封閉3 h。所用一抗為小鼠抗人KCN15單克隆抗體，孵育過(guò)夜。二抗為HRP標(biāo)記的兔抗鼠，室溫孵育1 h。洗膜后采用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(USA)曝光，Image Lab軟件分析。

1.8 胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的Jurkat細(xì)胞，重懸于loading buffer(1×106個(gè)/ml)，用Fluo-3AM(終濃度5μmol/L)染色細(xì)胞，37℃避光水浴30 min。用PBS清洗2次，再用Ca2+Estimation buffer 5 ml洗滌，以去除細(xì)胞外多余的熒光染料。隨后，以Ca2+Estimation buffer 1ml重懸細(xì)胞，取200 μl細(xì)胞懸液檢測(cè)靜息細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度，于流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm通道，測(cè)平均熒光強(qiáng)度(MFI)，記為F。將剩余細(xì)胞以Calcium Ionophore A23187負(fù)載(終濃度10 μmol/L)，室溫孵育10 min，取200 μl細(xì)胞懸液檢測(cè)MFI，記為Fmax；在剩余細(xì)胞加入400 mmol/L EGTA螯合鈣離子(終濃度10 mmol/L)，室溫孵育20 min，檢測(cè)MFI記為Fmin。胞內(nèi)鈣離子濃度計(jì)算公式：【Ca2+】=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)，Kd=0.4 μmol/L。

2 結(jié)果

2.1 人KCNJ15真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞情況 Jurkat細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pMAXGFP和pcDNA3.1(+)-hKCNJ15后48 h，在熒光顯微鏡下觀察，顯示轉(zhuǎn)染效率為80%～90%。采用Real-time PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KCNJ15在基因水平實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞為105.51 ± 0.58，對(duì)照組細(xì)胞為101.41 ± 1.16，兩者比較，P=0.001。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞蛋白表達(dá)亦明顯增強(qiáng)(見插頁(yè)圖1及圖2、圖3)。

圖2 3組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞KCNJ15基因表達(dá)圖

圖3 3組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞KCNJ15蛋白表達(dá)圖

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48 h 3組細(xì)胞培養(yǎng)液中各種細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1 3組Jurkat細(xì)胞分泌細(xì)胞因子比較

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h、48 h 3組細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2 3組細(xì)胞兩時(shí)段胞內(nèi)鈣離子結(jié)果比較

3 討論

KCNJ15是內(nèi)向整流鉀離子通道家族(KIR)的一員，也被稱為KIR4.2。KCNJ15基因編碼的是一個(gè)整合膜蛋白和內(nèi)向整流型鉀通道，在人的腎臟、肺、胚胎纖維細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及正常小鼠肝臟均有表達(dá)[5～8]，但其功能尚未完全明確。既往文獻(xiàn)報(bào)道，KCNJ15位于21號(hào)染色體，被認(rèn)為與唐氏綜合癥的臨床表現(xiàn)有關(guān)[9]。

既往研究表明，鉀離子通道在T淋巴細(xì)胞的分化以及抗原介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用。KCNJ15作為鉀離子通道基因，可能通過(guò)調(diào)節(jié)鉀離子流動(dòng)、鈣內(nèi)流從而影響人體免疫功能。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，KCNJ15在HBV-ACLF患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中高表達(dá)，后續(xù)研究也發(fā)現(xiàn)在MHV-3感染的暴發(fā)性肝炎小鼠模型中，肝臟T淋巴細(xì)胞表達(dá)KCNJ15水平顯著升高，因而我們推測(cè)該分子可能通過(guò)影響T細(xì)胞的活化及功能從而參與免疫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)KCNJ15的Jurkat細(xì)胞分泌IL17-A的水平明顯升高。

Th17細(xì)胞是具有獨(dú)特免疫學(xué)功能的CD4+T細(xì)胞亞群，其主要分泌的細(xì)胞因子IL-17A在宿主對(duì)病原體感染的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，IL-17A的異常分泌又與自身免疫性疾病、腫瘤發(fā)生均密切相關(guān)[10]。目前研究認(rèn)為Th17細(xì)胞在多種肝臟疾病如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎(CHB)、酒精性肝病中發(fā)揮調(diào)節(jié)天然免疫、獲得性免疫及自身免疫的作用。研究報(bào)道，乙型重型肝炎患者和急性乙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞比例顯著高于輕度CHB患者和健康對(duì)照人員，并且，升高的Th17細(xì)胞比例與患者血清ALT水平呈正相關(guān)[11，12]。此外，也有研究指出，Th17細(xì)胞在HBV誘導(dǎo)的肝硬化中也啟動(dòng)一系列免疫介導(dǎo)的病理?yè)p傷，在肝硬化致病機(jī)制中起著重要作用[13，14]。這些研究表明Th17細(xì)胞可能與乙型肝炎疾病進(jìn)展和肝臟損傷的病理過(guò)程緊密相關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)KCNJ15能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-17從而推測(cè)KCNJ15在HBV-ACLF中發(fā)揮免疫介導(dǎo)肝損傷作用。而KCNJ15如何促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-17？基于目前對(duì)于鉀離子通道的認(rèn)識(shí)，KCNJ15主要通過(guò)改變細(xì)胞膜電位從而影響細(xì)胞功能。另有研究報(bào)道，阻斷腸道T細(xì)胞上Ca2+活化的鈣通道可以抑制T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，包括IFN-γ、IL-2、IL-17等[15]。因此，我們推測(cè)，KCNJ15可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子水平而影響T細(xì)胞的功能。于是我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染KCNJ15表達(dá)質(zhì)粒后Jurkat細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)KCNJ15的Jurkat細(xì)胞，胞內(nèi)鈣離子水平在轉(zhuǎn)染后24 h顯著升高。這與我們推測(cè)相符，KCNJ15可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流從而影響T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如IL-17的表達(dá)水平。但這一通路的具體機(jī)制有待更加深入的研究。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察了過(guò)表達(dá)KCNJ15時(shí)Jurkat細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及鈣內(nèi)流的情況，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探討了KCNJ15分子對(duì)T細(xì)胞功能的影響及機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步研究KCNJ15參與HBV-ACLF的免疫學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。