黃倩，林佩璜，鄭丹丹，黃秋虹，王梅愛，陳慧勤，施子祿（.泉州醫(yī)學高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部生理教研室，福建泉州 36200；2.福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建泉州 362000）

腎缺血再灌注損傷（RIRI）是造成臨床急性腎衰竭的高危因素，其病理機制復雜，可能與再灌注后繼發(fā)的急性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]。Toll樣受體4（TLR4）是TLR家族中發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣泛的模式識別受體之一，研究發(fā)現(xiàn)，TLR4能夠特異性識別革蘭氏陰性細菌細胞壁上的脂多糖，并通過啟動髓樣分化因子88和Toll白細胞介素受體兩條信號通路介導多種促炎因子的釋放[2]。此外，TLR4也可引起絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）等多條信號轉(zhuǎn)導通路[3]的活化，而作為MAPKs系統(tǒng)家族成員之一的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）可能在RIRI中發(fā)揮著重要的作用[4]，如李榮山等[5]采用p38MAPK特異性抑制劑SB203580抑制RIRI引起的p38MAPK信號通路的激活后，腎損傷得到明顯緩解。另有研究發(fā)現(xiàn)，在肝炎[6]或糖尿病腎病[7]時，TLR4可誘導p38MAPK的活化，進而確定了TLR4與p38MAPK間的上下游關(guān)系。

桑枝多糖（Ramulus moripolysaccharides，RMP）是從桑科植物桑樹（Morus albaL.）的干燥樹枝及嫩枝中提取得到的一種水溶性雜多糖，具有降糖、調(diào)脂、抗炎、抗氧化等多種藥理活性。有研究表明，桑枝及其提取物均可明顯減輕小鼠腦缺血組織損傷[8-9]，而作為主要活性成分的RMP對腎臟有著很好的保護作用[10]。然而，目前對RMP的研究多集中于糖尿病或糖尿病腎病[10]，而關(guān)于其對RIRI的研究迄今未見文獻報道。基于此，本研究擬通過建立小鼠RIRI模型，觀察RMP預防性給藥是否對RIRI小鼠有保護作用，并從TLR4/p38MAPK通路探討其可能的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7100全自動生化分析儀（日本日立公司）；UVmini-1240紫外-可見分光光度計[日本島津國際貿(mào)易（上海）有限公司]；ELX800光吸收酶標儀（美國Bio-Tek公司）；CX31-32C02光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；5810高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；MU4200DUVF超純水儀（上海淼康實業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑枝采于浙江大學華家池校區(qū)桑園內(nèi)，經(jīng)浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院張素萍博士鑒定為?？浦参锷涞母稍锬壑?；阿托伐他汀片（大連輝瑞制藥有限公司，批號：111010K，規(guī)格：10 mg）；小鼠白細胞介素1β（IL-1β）、IL-10酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號：E-EL-M0037、E-EL-M0046）；IL-6、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：EK0411、YM-U6120）；兔源性抗TLR4多克隆抗體（批號：ab13556）、兔源性抗p38MAPK單克隆抗體（批號：ab170099）、兔源性抗磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）多克隆抗體（批號：ab4822）和內(nèi)參兔源性抗β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號：ab8227）均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（批號：A0208）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號：P0015）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物

60只成年C57BL/6小鼠，♂，8～12周齡，SPF級，體質(zhì)量21～25 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[使用許可證號：SYXK（滬）2017-0005]。飼以標準顆粒飼料，自由飲水，5只/籠，飼養(yǎng)于人工黑暗和光照交替（12 h/12 h）、溫度在22℃左右、濕度在50%左右的環(huán)境中。

2 方法

2.1 RMP的提取與精制

桑枝切片后于45℃烘箱中烘干，粉碎備用。取桑枝粗粉50 g，按一定比例加入石油醚500 mL，90℃水浴中回流1 h，抽濾。濾渣揮發(fā)干后，加80%乙醇500 mL，100℃水浴中回流提取2次，每次1 h，抽濾。待濾渣揮干后，加入雙蒸水500 mL，超聲（頻率：80 kHz，功率：220 W）處理40 min，100℃水浴中回流提取2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，經(jīng)40 000 r/min離心10 min，收集上清液，真空干燥后得濃縮液200 mL，加入一定體積乙醇，使乙醇終體積分數(shù)為80%，充分拌勻后，4℃靜置過夜，抽濾，收集沉淀物，即為桑枝粗多糖。將粗多糖置于蒸餾水中溶解，Sevage法多次萃取后除去蛋白質(zhì)，流動自來水連續(xù)透析48 h，再用雙蒸水連續(xù)透析24 h，在透析液中加入一定體積乙醇，使乙醇終體積分數(shù)為80%，充分拌勻后，4℃靜置過夜，抽濾，45℃真空干燥，所得即為精制RMP，經(jīng)紫外光譜[11]測定樣品中的RMP純度達86.3%。

2.2 RIRI模型的制備

RIRI模型的具體制備過程如下[12-13]：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉小鼠，于腹正中線行縱行切口（2.0～2.5 cm），暴露并游離雙側(cè)腎臟腎蒂。用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎臟腎蒂，阻斷45 min后，去除動脈夾恢復血流再灌24 h。模型制備成功的判定標準[13]：術(shù)中小鼠腎臟由鮮紅色變成紫黑色，去除動脈夾后，腎臟又由紫黑色轉(zhuǎn)為鮮紅色，且術(shù)后3 h內(nèi)小鼠恢復清醒。假手術(shù)組小鼠僅打開腹腔并分離雙側(cè)腎臟腎蒂，不予夾閉。

2.3 分組與給藥

將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分成6組，即假手術(shù)組、模型組、阿托伐他汀組（陽性對照，15 mg/kg）[14]和RMP低、中、高劑量（300、600、1 200 mg/kg）[10]，每組10只。4個給藥組小鼠于術(shù)前1周每天同一時間點分別灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。末次給藥1 h后，按“2.2”項下方法進行手術(shù)。

2.4 指標檢測

2.4.1 血清中Scr和BUN水平的檢測 缺血45 min再灌注24 h后，各組選取7只小鼠（因造模過程中造模組均有2～3只小鼠造模失敗，故最終每組選7只小鼠進行實驗），麻醉后下腔靜脈取血，室溫靜置1 h，待血液自然凝固后以3 000 r/min離心10 min，收集血清。取部分血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中Scr和BUN水平。

2.4.2 腎臟病理組織學變化觀察 取血后，將小鼠迅速處死并取相同部位腎組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（3 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察其腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4.3 血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平檢測 取“2.4.1”項下剩余部分血清，按照ELISA試劑盒上的步驟檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2.4.4 腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達水平檢測 各組選取6只小鼠[因人為因素，造成RMP高劑量組小鼠皮質(zhì)（1份）損壞，為保證每組數(shù)量統(tǒng)一，最終每組選擇6只小鼠進行實驗]取相同部位腎皮質(zhì)，冰上玻璃勻漿器研磨組織后加相應(yīng)比例（20 mg/200 μL）預冷的蛋白裂解液，繼續(xù)研磨至勻漿，然后在4℃下以14 000 r/min離心5 min，留上清。取30 μL上清液采用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。取蛋白樣品（30 μg）進行SDS-PAGE電泳分離，然后以260 mA恒流電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（PVDF膜）上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，置于含5%脫脂奶粉的洗滌液中室溫封閉1 h，分別加入TLR4抗體（1∶1 000）、p38MAPK抗體（1∶3 000）、p-p38MAPK抗體（1∶1 000）和內(nèi)參β-actin抗體（1∶3 000），4 ℃搖床過夜，次日洗膜后加入HRP標記的二抗，室溫搖床孵育1.5 h，增強化學發(fā)光（ECL）發(fā)光、顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行圖像分析，獲取各組蛋白條帶的光密度值，以目的蛋白光密度值與β-actin光密度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 RMP預防性給藥對RIRI模型小鼠血清中Scr和BUN水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中Scr和BUN水平明顯升高（P＜0.01），提示RIRI造模成功；與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠血清中Scr和BUN水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明RMP預防性給藥能夠減輕小鼠RIRI癥狀。各組小鼠血清中Scr和BUN水平測定結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清中Scr、BUN水平測定結(jié)果（±s，n＝7）Tab 1 Serum levels of Scr and BUN of mice in each group（±s，n＝7）

表1 各組小鼠血清中Scr、BUN水平測定結(jié)果（±s，n＝7）Tab 1 Serum levels of Scr and BUN of mice in each group（±s，n＝7）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

BUN，mmol/L 6.59±0.64 35.27±3.69＊＊19.54±2.41##29.55±3.02#24.48±2.87##19.87±2.42##組別假手術(shù)組模型組阿托伐他汀組RMP低劑量組RMP中劑量組RMP高劑量組劑量，mg/kg 15 300 600 1 200 Scr，μmol/L 21.35±2.54 175.61±20.38＊＊80.42±9.28##124.57±14.26#106.48±11.59##83.76±9.44##

3.2 RMP預防性給藥對RIRI模型小鼠腎臟病理組織學變化的影響

假手術(shù)組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細胞排列整齊。模型組小鼠腎組織中腎小管上皮細胞大量變性壞死、脫落，腎小管管腔明顯擴張，管腔中可見管型，間質(zhì)充血與炎癥細胞浸潤。與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠腎臟病理損傷均得到不同程度改善，表現(xiàn)為腎小管上皮細胞腫脹、壞死、脫落程度、炎癥細胞浸潤程度減輕，其中RMP中、高劑量組較為效果顯著，但RMP低劑量組效果不明顯，這說明中、高劑量RMP預防性給藥能夠減輕RIRI模型小鼠腎組織病理損傷，結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟病理組織學觀察結(jié)果（×200）Fig 1 Observation of renal histopathological of mice in each group（×200）

3.3 RMP預防性給藥對RIRI模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠血清中IL-1β和IL-6水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），阿托伐他汀組和RMP高劑量組小鼠血清中IL-10水平進一步升高（P＜0.05），阿托伐他汀組和RMP中、高劑量組小鼠血清中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），這表明RMP預防性給藥能夠減輕RIRI后的炎癥損傷，且以RMP中、高劑量效果最為明顯，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平測定結(jié)果（±s，n＝7，ng/L）Tab 2 Serum levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α of mice in each group（±s，n＝7，ng/L）

表2 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平測定結(jié)果（±s，n＝7，ng/L）Tab 2 Serum levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α of mice in each group（±s，n＝7，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α 38.65±1.97 81.24±5.35＊＊55.47±4.07##78.57±5.26 69.46±4.78#57.12±4.16##組別假手術(shù)組模型組阿托伐他汀組RMP低劑量組RMP中劑量組RMP高劑量組劑量，mg/kg 15 300 600 1 200 IL-1β 3.14±0.12 9.55±0.54＊＊5.21±0.24##7.43±0.46#6.01±0.39##5.63±0.36##IL-6 52.67±2.16 85.83±4.15＊＊58.65±3.43##71.47±4.06#70.68±3.98#64.31±3.55##IL-10 18.57±0.56 22.62±0.85＊＊32.75±1.33##22.75±0.85 23.16±0.91 30.42±1.27##

3.4 RMP預防性給藥對RIRI模型小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4和p-p38MAPK蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明RMP對RIRI小鼠的抗炎作用可能與抑制TLR4/p38MAPK信號通路激活有關(guān)。各組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表3。

圖2 各組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoregram of protein expressions of TLR4，p38MAPK and p-p38MAPK in renal cortex of mice in each group

表 3 各組小鼠腎皮質(zhì)中 TLR4、p38MAPK、pp38MAPK蛋白表達水平測定結(jié)果（x±s，n＝6）Tab 3 Protein expressions of TLR4，p38MAPK and p-p38MAPK in renal cortex of mice in each group（x±s，n＝6）

4 討論

組織或器官缺血后再恢復缺血區(qū)的血流供應(yīng)，往往會引起更為嚴重的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙[15]。腎臟作為高灌注器官，對缺血及再灌注均比較敏感[16]，缺血會導致腎血流量下降，腎小管阻塞，嚴重者腎小管壞死，導致再灌注后腎損傷，甚至引起急性腎衰竭[17]。因此，抑制再灌注損傷是預防缺血性急性腎衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血清Scr和BUN水平在一定程度上可反映腎功能的損害程度，是常用的觀察腎功能狀況的指標。本研究通過構(gòu)建RIRI小鼠模型，觀察RMP預防性給藥對小鼠RIRI的保護作用，結(jié)果顯示RMP預防性給藥能夠減輕RIRI小鼠的腎功能，明顯降低其血清中Scr及BUN水平，同時，病理切片也證實了RMP對小鼠腎臟結(jié)構(gòu)損傷的改善作用。阿托伐他汀對預防RIRI具有積極的作用，研究顯示阿托伐他汀可能通過TLR4信號途徑發(fā)揮其非依賴降血脂的腎臟保護作用[14]，按照公認有效、同類可比的原則，故選用阿托伐他汀作為本研究的陽性對照藥。

RIRI發(fā)病機制非常復雜，主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細胞凋亡、鈣超載等，而炎癥損傷在其發(fā)病過程中具有重要作用[18]。TLR4/p38MAPK是介導細胞增殖、凋亡、分化以及細胞炎癥等作用的關(guān)鍵性信號通路，近年來，細胞內(nèi)TLR4/p38MAPK信號通路的活化在器官缺血再灌注損傷中的作用備受關(guān)注。有研究顯示，發(fā)生肝缺血再灌注誘導的急性肺衰竭[19]或缺血再灌注心肌損傷時[20]，TLR4/p38MAPK信號通路均被激活，通過促進炎性細胞因子和凋亡誘導因子生成等許多途徑誘導細胞死亡，從而在缺血再灌注損傷病理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后，小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK以及p-p38MAPK蛋白表達水平均明顯升高，說明TLR4/p38MAPK信號通路被激活，而RMP預防性給藥后能不同程度地抑制RIRI誘導的TLR4和p-p38MAPK蛋白高表達，從而使TLR4/p38MAPK信號通路失活，這可能是其發(fā)揮腎保護作用的分子機制之一。

另有研究表明，臟器缺血后TLR4/p38MAPK信號通路的激活使組織中的單核細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等炎癥細胞大量活化，產(chǎn)生和分泌大量炎性細胞因子，這些炎性細胞因子多具有免疫調(diào)節(jié)作用，廣泛參與細胞生長、分化、修復和免疫過程，此外，炎性細胞因子密切關(guān)聯(lián)機體的炎癥反應(yīng)，引發(fā)細胞因子反應(yīng)逐級放大的瀑布效應(yīng)，進而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。炎性細胞因子包括促炎細胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α等）和抗炎細胞因子（IL-10等），促炎細胞因子在炎癥反應(yīng)的誘導和延續(xù)中起主要作用，而抗炎細胞因子可反過來抑制炎癥細胞釋放促炎細胞因子、趨化因子等細胞因子，促炎細胞因子和抗炎細胞因子的失衡被認為是RIRI發(fā)生的基礎(chǔ)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后，小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平明顯升高，RMP預防性給藥后能不同程度地抑制RIRI引起的血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高，并且高劑量RMP還能進一步升高血清IL-10水平，說明RMP具有減輕缺血損傷后炎性細胞因子瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，增強抗炎效應(yīng)，從而發(fā)揮其對RIRI小鼠的保護作用。

綜上所述，RMP預防性給藥對RIRI小鼠的保護作用可能與抑制TLR4/p38MAPK信號通路激活，進而改善腎功能，減輕腎臟病理損傷，減輕炎癥損傷，增強抗炎等作用有關(guān)。