郭志淵，趙欣慶，朱恒怡，袁 軍（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，成都 611731）

福多司坦于1988年由日本SS制藥株式會(huì)社研發(fā)創(chuàng)制，1990年與同仁醫(yī)藥化工株式會(huì)社開(kāi)展臨床試驗(yàn)[1-2]，2001年12月7日首次在日本上市[3]。福多司坦作為一類高效祛痰藥物[4]，應(yīng)用前景較好。目前，國(guó)內(nèi)制備福多司坦原料藥的工藝有2種，一種是鹽酸半胱氨酸與烯丙醇反應(yīng)制得[5]，另一種是鹽酸半胱氨酸與3-鹵代-1-丙醇反應(yīng)制得[6]。國(guó)內(nèi)上市的福多司坦口服固體制劑有片劑、膠囊劑及顆粒劑。

在福多司坦原料藥及其制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[7-9]中，有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法雖各不相同，但均僅控制了未知雜質(zhì)及福多司坦右旋異構(gòu)體。然而，根據(jù)化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[10]要求，無(wú)論原料或制劑含量大于鑒定閾值的雜質(zhì)都應(yīng)進(jìn)行鑒定，明確雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)并對(duì)其限度進(jìn)行研究。在2018年仿制藥一致性評(píng)價(jià)中，為了區(qū)分福多司坦各仿制藥工藝的差異及質(zhì)量的優(yōu)劣，筆者收集了相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道的福多司坦中的檢測(cè)出的有關(guān)雜質(zhì)，如半胱氨酸（雜質(zhì)A）、胱氨酸（雜質(zhì)B）、福多司坦亞砜（雜質(zhì)C）、（2R，2'R）-3，3'-（丙基-1，3-二硫代）雙（二氨基丙酸）（雜質(zhì)E）、（-）-（R）-2-（3-羥丙基）氨基-3-（3-羥丙基硫代）丙酸（雜質(zhì)F）、（-）-（R）-2-氨基-3-（3-氯丙基硫代）丙酸（雜質(zhì)G），并采用高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法及加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)福多司坦原料藥及其仿制藥生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的片劑、膠囊劑中的這些雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，以期為福多司坦仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供參考。福多司坦及其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 福多司坦及其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of fudosteine and its impurities

1 材料

1.1 儀器

2695 HPLC儀（美國(guó)Waters公司）；1260 HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；CPA225D電子天平、A8000多參數(shù)測(cè)量酸度計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

福多司坦對(duì)照品（批號(hào)：100920-201802，純度：99.5%）、雜質(zhì)B對(duì)照品（批號(hào)：140632-200502，純度：99.3%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)A對(duì)照品（加拿大TRC公司，批號(hào)：2-MJJ-156-1，純度：97.0%）；雜質(zhì)C對(duì)照品（美國(guó)CRTO公司，批號(hào)：C4X-14471-1709，純度：98.7%）；雜質(zhì)E對(duì)照品（批號(hào)：WS-T170608X，純度：95.9%）、雜質(zhì)F對(duì)照品（批號(hào)：WS-T170110Z-1，純度：95.6%）、雜質(zhì)G對(duì)照品（批號(hào)：ES7818-4-P1，純度：94.4%）均由本實(shí)驗(yàn)室自制；福多司坦原料藥1（A企業(yè)，批號(hào)：FD160871，純度：99.2%）；福多司坦原料藥2（批號(hào)：160806008，純度：99.9%）、福多司坦膠囊2（批號(hào)：160910056，規(guī)格：0.2 g）均購(gòu)自B企業(yè)；福多司坦原料藥3（批號(hào)：H160404，純度：99.4%）、福多司坦片1（批號(hào)：B160201161，規(guī)格：0.2 g）、福多司坦膠囊 1（批號(hào)：1607001，規(guī)格：0.2 g）均購(gòu)自C企業(yè)；福多司坦原料藥4（D企業(yè)，批號(hào)：160309-1，純度：99.1%）；福多司坦原料藥5（批號(hào)：1610001，純度：99.9%）、福多司坦片2（批號(hào)：057170101，規(guī)格：0.2 g）均購(gòu)自E企業(yè)；福多司坦片3（F企業(yè)，批號(hào)：1607201，規(guī)格：0.2 g）、福多司坦片4（G企業(yè)，批號(hào)：160702，規(guī)格：0.2 g）、福多司坦膠囊3（H企業(yè)，批號(hào)：1606003，規(guī)格：0.2 g）；己烷磺酸鈉、乙腈為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀等為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件1（用于檢測(cè)雜質(zhì)A、B、C）：色譜柱為MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.12%己烷磺酸鈉溶液（pH 2.0），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件2（用于檢測(cè)雜質(zhì)E、F、G和其他未知雜質(zhì)）：色譜柱為Altech Altima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（A）-乙腈（B）-水（C），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 雜質(zhì)對(duì)照品溶液的制備 （1）雜質(zhì)A、B、C混合對(duì)照品溶液：精密稱取雜質(zhì)A、B、C對(duì)照品適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液溶解并稀釋制成各雜質(zhì)質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的對(duì)照品溶液。（2）福多司坦及雜質(zhì)E、F、G混合對(duì)照品溶液：精密稱取福多司坦對(duì)照品及雜質(zhì)E、F、G對(duì)照品適量，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成福多司坦及雜質(zhì)E、F、G質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取福多司坦原料藥或其制劑內(nèi)容物100 mg，分別置于50 mL量瓶中，加0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液1、2。

2.2.3 自身對(duì)照溶液的制備 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液0.1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為自身對(duì)照溶液1、2。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液 取福多司坦及雜質(zhì)A、B、C對(duì)照品適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液制成每1 mL含福多司坦2 mg和雜質(zhì)A、B、C各2 μg的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液1；取福多司坦與雜質(zhì)E、F、G對(duì)照品適量，加“2.1”項(xiàng)下0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液制成每1 mL含福多司坦2 mg和雜質(zhì)E、F、G各2 μg的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液2。

2.2.5 空白輔料溶液 將各廠家福多司坦片、膠囊的輔料按配方量混合，并稱取相當(dāng)于最大片質(zhì)量1/2的輔料量置于50 mL量瓶中，分別用0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解作為空白輔料溶液1、2。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.4”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液1、2，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，空白輔料峰無(wú)干擾，福多司坦峰與各雜質(zhì)峰間無(wú)干擾，分離度均＞1.5，各雜質(zhì)峰理論板數(shù)均＞3 000，雜質(zhì)E、F、G的相對(duì)保留時(shí)間為0.88、1.95、3.08。系統(tǒng)適用性色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 Chromatograms of system suitability test

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 取福多司坦片（批號(hào)：B160201161），研磨成細(xì)粉，取福多司坦粉末100 mg，分別置于50 mL量瓶中，共6份，一份為未破壞樣品，另5份按以下條件進(jìn)行破壞。（1）酸破壞：加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，水浴加熱30 min，放冷后，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL中和，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為酸破壞樣品。（2）堿破壞：加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，水浴加熱30 min，放冷后，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL中和，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為堿破壞樣品。（3）高溫破壞：加水適量溶解后，置于105 ℃下加熱30 min，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為高溫破壞樣品。（4）光照破壞：加水適量溶解后，置于紫外燈（波長(zhǎng)254 nm）下照射2 d后，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為光照破壞樣品。（5）氧化破壞：加10%過(guò)氧化氫溶液1 mL，立即用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為氧化破壞樣品。取上述6種樣品20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，在不同破壞條件下，各降解產(chǎn)物峰均能與主峰完全分離，表明該方法專屬性良好。專屬性試驗(yàn)色譜圖見(jiàn)圖3。

2.3.3 線性關(guān)系及校正因子考察 分別取“2.2.1（1）”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液稀釋制成每1 mL中含雜質(zhì)A、B、C均為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg的系列溶液；另取“2.2.1（2）”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋制成每1 mL中含福多司坦和雜質(zhì)E、F及G均為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 μg的系列溶液。精密吸取上述溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以福多司坦或各雜質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，并以方程斜率（K）計(jì)算雜質(zhì)E、F、G的校正因子（校正因子＝K福多司坦/K雜質(zhì)E/F/G），線性關(guān)系及校正因子考察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系及校正因子Tab 2 Linear relationships and correction factors

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的各雜質(zhì)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄福多司坦及各雜質(zhì)的峰面積。結(jié)果，福多司坦及各雜質(zhì)峰面積的RSD均小于1.2%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.5 檢測(cè)限與定量限考察 取“2.2.1”項(xiàng)下福多司坦及各雜質(zhì)的對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析。以信噪比為3∶1計(jì)算檢測(cè)限，以信噪比為10∶1計(jì)算定量限。結(jié)果，福多司坦及雜質(zhì)A、B、C、E、F、G的檢測(cè)限分別為2.06、5.57、1.01、1.99、2.22、4.21、4.43 ng，定量限分別為4.12、11.14、2.02、3.98、4.45、8.42、8.85 ng。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 3 Chromatograms of specific test

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、24 h后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A在4 h內(nèi)峰面積的RSD＜2.0%（n＝3），福多司坦及雜質(zhì)B、C、E、F、G在24 h內(nèi)峰面積的RSD均＜1.0%（n＝7），表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)混合對(duì)照品溶液適量，置于已稱有一定空白輔料和福多司坦原料藥5的量瓶中，制備相當(dāng)于雜質(zhì)含量20%、100%、150%的供試品溶液，每個(gè)濃度各3份，取上述供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積，雜質(zhì)A、B、C按外標(biāo)法計(jì)算各雜質(zhì)回收率，雜質(zhì)E、F、G按加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)加樣回收率。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、E、F、G平均加樣回收率分別為98.0%、97.3%、102.4%、99.4%、98.9%、96.4%，RSD分別為1.4%、1.5%、1.1%、0.9%、1.2%、0.5%（n＝9）。

2.3.8 樣品中各雜質(zhì)含量檢測(cè) 分別取各生產(chǎn)企業(yè)的原料藥或制劑樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，然后取該樣品溶液按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備自身對(duì)照溶液，然后取上述溶液適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積。雜質(zhì)A、B、C按外標(biāo)法計(jì)算其在樣品中的含量，雜質(zhì)E、F、G按加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算其在樣品中的含量，由于樣品中還有其他未知雜質(zhì)，因此，筆者采用自身對(duì)照法[15]對(duì)其他未知雜質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。樣品中各雜質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中各雜質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果（%%）Tab 3 Results of content determination of the impurities in samples（%%）

3 討論

3.1 色譜系統(tǒng)選擇

福多司坦各雜質(zhì)極性相差較大，其中雜質(zhì)A、B、C的極性較大，在低pH的0.12%己烷磺酸鈉溶液中能夠得到良好分離，但在該色譜條件1下無(wú)法將極性較小的雜質(zhì)E、F、G洗脫出來(lái)，故使用極性較小的色譜條件2對(duì)其進(jìn)行分離。福多司坦右旋異構(gòu)體在標(biāo)準(zhǔn)中有檢測(cè)方法，因此，本文沒(méi)有再進(jìn)行研究。

3.2 雜質(zhì)來(lái)源分析

福多司坦中雜質(zhì)A為起始物料，雜質(zhì)B為起始物料中的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，雜質(zhì)E、F、G為反應(yīng)副產(chǎn)物，其中雜質(zhì)G為鹽酸半胱氨酸與3-鹵代-1-丙醇反應(yīng)的特定副產(chǎn)物，雜質(zhì)C為福多司坦氧化降解產(chǎn)物。由強(qiáng)制降解試驗(yàn)可知，福多司坦的主要降解產(chǎn)物為雜質(zhì)C，在堿降解中還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)較大的未知降解雜質(zhì)，但因樣品中均未檢出這幾個(gè)雜質(zhì)，且未制備有相應(yīng)的對(duì)照品，所以此次試驗(yàn)未對(duì)這幾個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行定量研究。

3.3 雜質(zhì)的限度

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在福多司坦原料藥及其制劑中，雜質(zhì)C、E和G含量較高，約0.1%～0.2%。福多司坦制劑每日最大服用劑量為1.2 g，各雜質(zhì)為非毒性雜質(zhì)，根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[10]，建議將工藝雜質(zhì)A、B、E、F、G限度定為0.15%，降解雜質(zhì)C可適當(dāng)放寬限度，其他單個(gè)未知雜質(zhì)限度定為0.1%，雜質(zhì)總量限度定為1.0%。

綜上所述，不同企業(yè)福多司坦原料藥中雜質(zhì)含量存在差異，從而使得其各制劑中有關(guān)物質(zhì)的含量參差不齊。因此，建議仿制藥企業(yè)完善福多司坦原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，為其仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。