溫二生，楊柳珍，鐘曉鵬，邱 甜，游 靜，余子云，黃志華，薛進華，陳 濤

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1.2017級本科生；2.2016級本科生，江西 贛州 341000)

帕金森病(Parkinson's Disease, PD)是常見的與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，由于人口老齡化加劇，我國PD患者數(shù)量逐年增加。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，65歲以上人群PD的發(fā)病率高達1.7%[1]。PD患者在臨床上主要有肌肉僵直、運動遲緩、靜止性震顫等運動癥狀和焦慮、抑郁、自主神經(jīng)功能紊亂以及認(rèn)知功能障礙等非運動癥狀，認(rèn)知功能障礙常發(fā)生在PD早期階段[2-3]，PD患者約25%合并輕度認(rèn)知功能障礙，最終約80%發(fā)展為輕度認(rèn)知障礙和帕金森病癡呆[4]。PD認(rèn)知功能障礙的發(fā)生機制還不清楚，可能與海馬區(qū)神經(jīng)元的樹突可塑性改變有關(guān)。小GTP酶Rho家族主要包括細胞分裂周期蛋白 42 (cell division cycle 42, Cdc42)，Ras相關(guān)C3肉毒菌毒物底物1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)和Ras同源成員A (Ras homologous member A, RhoA)，在神經(jīng)過程的起始、生長、引導(dǎo)和分支中起著關(guān)鍵作用[5]，可通過影響肌動蛋白細胞骨架的組裝和穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生[6]。RhoA能夠抑制神經(jīng)突的延伸，而Cdc42和Rac1是神經(jīng)突向外生長的正調(diào)節(jié)因子，其中Cdc42能夠調(diào)節(jié)細胞周期，促進細胞的增殖，以及調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架重組影響細胞的運動，另外Cdc42還可以通過促進肌動蛋白的形成有利于神經(jīng)元的存活和再生。最近的研究表明PD的病理生理學(xué)的改變與Cdc42信號傳導(dǎo)密切相關(guān)[7]。本實驗用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)制備PD小鼠模型，研究Cdc42在PD小鼠海馬區(qū)的變化，并探討Cdc42在PD認(rèn)知功能中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物C57BL/6鼠， 8～12周齡，雄性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(湘)2016-0002]，常規(guī)鼠籠飼養(yǎng)，恒溫恒濕，12 h晝夜節(jié)律控制，自由進食和飲水。本實驗設(shè)計和所有操作步驟均符合動物倫理。

1.2試劑及藥物高鎂離子蛋白裂解液(MLB)，lgepal CA-630，NaF，EDTA，leupeptin，aprotinin購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；OCT 包埋劑購自Miles Scientific 公司；BCA 法蛋白檢測試劑盒，碧云天；ECL 曝光液，Millipore 公司；mouse anti Cdc42：BD 公司； rabbit anti Cdc42：Millipore 公司； mouse anti Cdc42：Santa 公司；HRP 二抗購自Dako 公司。

1.3實驗方法

1.3.1PD小鼠模型的制備將MPTP·HCl溶于無菌生理鹽水中，以30 mg·kg-1的劑量，腹腔注射5天，制備PD小鼠模型[8]。

1.3.2動物分組及藥物處理Control組：每天一次，連續(xù)5天腹腔注射生理鹽水，注射劑量與MPTP相同。MPTP組： 每天一次，連續(xù)5天腹腔注射MPTP·HCl (30 mg·kg-1)。

1.3.3新物體識別實驗實驗在規(guī)格為25 cm×25 cm×25 cm的箱體中進行。實驗分為適應(yīng)階段、訓(xùn)練階段和測試階段，為期3天。所有的設(shè)備在不同小鼠和階段都用水清理干凈。測試階段采取雙盲法記錄5 min，小鼠在示例物體或新物體1 cm 范圍內(nèi)的活動時間為探索時間，去除小鼠站立在物體上的時間。

1.3.4改良Y-迷宮實驗改良Y-迷宮實驗基于動物對未探索區(qū)域的先天偏好，評估短期空間記憶能力。Y迷宮的三個臂由木板(長18 cm，寬6 cm，高6 cm)組成，離地面高度50 cm。實驗包括兩部分：訓(xùn)練和測試，各8 min，兩部分實驗間隔120 min。訓(xùn)練階段，關(guān)閉一個臂(“新奇”)，將小鼠從其他兩臂的一個臂末端(“起始”)面向中心放入，讓其在起始和其他臂之間選擇。訓(xùn)練完成后，將小鼠取出，單籠放置120 min。測試階段，打開“新奇”的臂，再次從起始臂放入小鼠，讓其對三個臂自由探索8 min，記錄進入新打開臂的次數(shù)和停留時間。

1.3.5Westernbloting測定海馬區(qū)Cdc42的表達取新鮮的海馬組織，用細胞裂解液裂解組織，4 ℃，12 000 g離心5 min，BCA法蛋白定量，SDS/PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉，孵育一抗置于4 ℃過夜，室溫孵育二抗1 h，化學(xué)發(fā)光，采集數(shù)據(jù)并進行灰度掃描分析。

1.3.6免疫組織化學(xué)染色10%水合氯醛麻醉小鼠，用4%多聚甲醛心臟灌注，快速取腦，4%多聚甲醛6～8 h，20%蔗糖過夜，30%蔗糖過夜，切片，厚度30 μm，漂片法進行免疫組織熒光染色。

2 結(jié) 果

2.1PD模型小鼠認(rèn)知能力的影響新物體識別實驗結(jié)果顯示，PD模型小鼠對新物體的探索時間明顯減少，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；改良Y迷宮實驗結(jié)果顯示，PD小鼠在新開放臂停留的時間顯著減少，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

2.2海馬神經(jīng)元樹突棘密度的變化取海馬區(qū)進行免疫熒光染色，計數(shù)CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度，結(jié)果如圖2所示，PD模型小鼠CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3PD模型小鼠海馬區(qū)Cdc42活性的變化在最后一針MPTP后24 h取海馬區(qū)組織進行GST pull-down實驗，檢測活化的Cdc42活性，結(jié)果顯示(圖3)，MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠海馬區(qū)活化Cdc42的活性降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：**P<0.01，與對照組相比，n=9，t=4.6，P=0.0003。

注：**P<0.01，與對照組(n=7)相比，MPTP組(n=6)t=6，P<0.01。

注：**P<0.01，與對照組相比，n=4，t=5.406，P=0.0029。

3 討 論

PD是常見的與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，由于人口老齡化加劇，我國PD患者數(shù)量逐年增加。以往對PD的研究主要針對其運動癥狀，但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能障礙常發(fā)生在PD運動癥狀之前，主要有空間學(xué)習(xí)記憶和物體識別受損等表現(xiàn)[9]，其發(fā)生機制還不清楚。

海馬是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的重要腦區(qū)，也是人們研究學(xué)習(xí)、記憶最廣泛的區(qū)域，臨床研究發(fā)現(xiàn)PD患者海馬體積縮小[10]，海馬區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)進行性減少趨勢[11]。海馬神經(jīng)元樹突重塑異常在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但是在PD認(rèn)知功能障礙發(fā)病機制中的研究鮮有報道。本實驗結(jié)果顯示PD模型小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低。樹突棘是神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)，樹突棘密度的減少必然會影響突觸間的信息傳遞。Cdc42是小G蛋白Rho家族的重要成員，參與細胞骨架、細胞增殖與遷移的調(diào)控過程，Cdc42主要定位表達于神經(jīng)元樹突棘，而激活的Cdc42局限于活化的樹突棘，我們的研究結(jié)果顯示PD模型小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度減少，活化的Cdc42活性也降低，因此Cdc42可能參與樹突棘的重塑。綜上所述，PD模型小鼠認(rèn)知功能障礙可能與海馬區(qū)活化的Cdc42活性降低導(dǎo)致樹突棘密度減少有關(guān)。