林科佳 劉赴平 馬冬磊 胡銳 魏宗科 譚毅

（1. 深圳市潤科生物科技有限公司，深圳 518000；2. 東莞市南城醫(yī)院，東莞 523000；3. 中國人民大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)院，北京 100872）

與細(xì)胞傳代保存相比，細(xì)胞低溫冷凍保存可有效避免因細(xì)胞傳代過程中導(dǎo)致的污染、遺傳變異、大量人力財(cái)力付出，也可以最大限度保證細(xì)胞在長途轉(zhuǎn)移過程中的存活率［1-2]。大部分細(xì)胞都可通過程序降溫，最終長時(shí)間保存于液氮或液氮?dú)庀鄬又校?-4]。在細(xì)胞凍存降溫，保存及復(fù)蘇過程中，凍存劑的種類，降溫升溫速率及凍存細(xì)胞密度均是影響細(xì)胞凍存效果的因素［5-6]。目前細(xì)胞凍存密度對(duì)凍存效果影響相關(guān)文章及報(bào)道較少，CIK細(xì)胞是臨床腫瘤治療比較常見的細(xì)胞類型［7-8]，培養(yǎng)技術(shù)亦相當(dāng)成熟，研究者通過檢測(cè)復(fù)蘇后PBMC的活率以及CIK擴(kuò)增的擴(kuò)增倍數(shù)、淋巴細(xì)胞亞群、體外殺傷效率，探討細(xì)胞凍存密度對(duì)PBMC的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 分別采集3名健康志愿者外周血100 mL，在2 h內(nèi)對(duì)血液進(jìn)行處理。所有血液標(biāo)本收集均征得志愿者同意，并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 無血清培養(yǎng)基（GT-T511）購自日本TaKaRa公司，IFN-γ購自上海普欣生物技術(shù)有限公司，IL-1α、IL-2購自PeproTech公司，OKT3購自R&D公司，淋巴細(xì)胞分離液購自Nycomed Pharma AS公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3，PE標(biāo)記的CD4，PerCP標(biāo)記的CD8，APC標(biāo)記的CD56購自美國BD公司，Calcein-AM購自美國Thermo fisher公司，PI購自美國Sigma公司，DMSO購自美國Origen公司，K562白血病細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 PBMC提取 采集3名志愿者外周血各100 mL，轉(zhuǎn)移至離心管后離心，離心結(jié)束后，用移液器吸取上層淡黃色血漿層，并轉(zhuǎn)移到2個(gè)新的50 mL離心管內(nèi)并配平剩余的液體即為濃縮的血細(xì)胞，將裝有血漿的兩個(gè)離心管放入56℃水浴箱內(nèi)進(jìn)行補(bǔ)體滅活30 min后離心，離心完畢后，取上清備用，置于冰箱2-8℃保存。用生理鹽水稀釋濃縮的血細(xì)胞，并用Ficoll法離分單個(gè)核細(xì)胞，離盡管完畢后，取1 mL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式檢測(cè)。計(jì)數(shù)后，根據(jù)細(xì)胞密度用移液管從細(xì)胞懸液中吸出1.5×107個(gè)細(xì)胞，加入到另一個(gè)50 mL離心管中用作新鮮組PBMC細(xì)胞CIK培養(yǎng)，剩下的細(xì)胞用作凍存。用作新鮮CIK培養(yǎng)的細(xì)胞用10 mL無血清培養(yǎng)基重懸，取200 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活率檢測(cè)。根據(jù)細(xì)胞密度用移液管吸取1×107的細(xì)胞加入到T75培養(yǎng)瓶中，待用。用作凍存的細(xì)胞用3 mL 4℃預(yù)冷的自體血漿重懸，取200 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活率檢測(cè)，待用。

1.2.2 CIK細(xì)胞培養(yǎng) 在T75培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加無血清培養(yǎng)基到10 mL，控制細(xì)胞密度為1.0×106/mL，加入1 mL自體滅活血漿，加入1 000 U/mL IFN-γ。培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中添加0.1 μg/mL OKT3、1.0 ng/mL IL-1α與1 000 IU/mL IL-2，混勻，置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)每隔 2 d補(bǔ)液并計(jì)數(shù)，補(bǔ)液后細(xì)胞密度維持1.2×106/mL［9-10]。

1.2.3 PBMC凍存 將每名志愿者3 mL滅活補(bǔ)體血漿細(xì)胞懸液均分為3份，根據(jù)細(xì)胞密度，將細(xì)胞用凍存液配制成 2.0×107/mL，4.0×107/mL，6.0×107/mL三個(gè)密度［9，11-13]，凍存液最終配比為：自體血漿：DMSO=9∶1［14]，將3個(gè)密度的細(xì)胞吸入到1.8 mL凍存管中，每支凍存管中裝量為1 mL。每管貼上標(biāo)簽，放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，隔夜轉(zhuǎn)入-196℃氣相罐中。

1.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇及再培養(yǎng) 細(xì)胞凍存180 d后，對(duì)3個(gè)凍存細(xì)胞密度組細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。取出的凍存細(xì)胞管迅速放入37℃水浴鍋中，水浴至凍存管中留有微小冰塊，再用0.9%氯化鈉注射液重懸洗滌細(xì)胞，用10 mL無血清培養(yǎng)基分別對(duì)3個(gè)密度的細(xì)胞進(jìn)行重懸，記數(shù)后各取出1.0×107個(gè)細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基定容到10 mL，控制細(xì)胞密度為1.0×106/mL，分別吸入到3個(gè)T75培養(yǎng)瓶中；重復(fù)步驟1.4對(duì)復(fù)蘇后的3組細(xì)胞進(jìn)行CIK培養(yǎng)及計(jì)數(shù)［15]。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)細(xì)胞類型分為新鮮組（F組）和凍存組（A組、B組、C組）2大類，如圖1，其中新鮮組（F組）采用未凍存PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK；凍存組采用凍存PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，按凍存密度共分為 2.0×107/mL 組（A 組）、4.0×107/mL 組（B組）和6.0×107/mL組（C組），每組3個(gè)樣本，種瓶時(shí)控制細(xì)胞密度為1.0×106/mL，每瓶10 mL。

1.2.6 細(xì)胞表型檢測(cè) 收集三名志愿者新鮮PBMC（0 d），擴(kuò)增7 d及14 d的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×105/mL，F(xiàn)ITC-CD3標(biāo)記T細(xì)胞亞群，F(xiàn)ITC-CD3PE-CD4標(biāo)記輔助T細(xì)胞亞群，F(xiàn)ITCCD3PerCP-CD8標(biāo)記細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞群，F(xiàn)ITCCD3APC-CD56標(biāo)記NKT及NK細(xì)胞亞群。

1.2.7 腫瘤殺傷活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長的K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1.0-2.0×106cell/mL，加入calcein-AM，使終濃度為0.1-0.2 μmol/L，37℃培養(yǎng)箱避光孵育 30 min。離心，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗滌細(xì)胞2次，最后無血清的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為4.0×105cell/mL，分別取500 μL鋪于24孔培養(yǎng)板中。取新鮮PBMC或凍存PBMC制備的CIK細(xì)胞（調(diào)整細(xì)胞密度為8.0×106cell/mL），分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL，效靶比為20∶1，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照，放置在37度培養(yǎng)箱中，共同培養(yǎng)16 h。收集細(xì)胞，用緩沖液洗滌細(xì)胞2次，并用100 μL緩沖液重懸，加入2 μL的PI染色15 min，流式上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞殺傷效率。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用x-±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC凍存前后活率比較

分別將3個(gè)志愿者樣品3個(gè)凍存密度組PBMC（A 組 ：2.0×107/mL；B 組 ：4.0×107/mL；C 組 ：6.0×107/mL）迅速復(fù)蘇后緩慢加入生理鹽水中，并定容到20 mL，充分混勻后取樣計(jì)數(shù)和檢測(cè)活率與新鮮PBMC組（F組）對(duì)比。結(jié)果（表1）顯示，A組活率（95.6±0.4%）相對(duì)F組（96.0±0.3%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B組（94.7±0.2%）、C組（94.9±0.4%）相對(duì)F組有顯著差異（P＜0.05）。

表1 PBMC凍存前后活率（±s，n=3，%）

表1 PBMC凍存前后活率（±s，n=3，%）

組別 活率/%F組 96.0±0.3 A組 95.6±0.4 B組 94.7±0.2 C組 94.9±0.4

2.2 PBMC凍存前后誘導(dǎo)CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較

由 表 2可 以 看 出，F(xiàn)、A、B、C 4組 細(xì) 胞進(jìn)行CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，擴(kuò)增倍數(shù)分別達(dá)到 156.4±18.2、160.2±28.4、126.1±19.8和110.4±11.3倍，B、C組擴(kuò)增倍數(shù)和F組相比有顯著差異（P＜0.05），而A組與F組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 PBMC凍存前后誘導(dǎo)ECIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較（±s，n=3）

表2 PBMC凍存前后誘導(dǎo)ECIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較（±s，n=3）

F組 A組 B組 C組0 d 1.0 1.0 1.0 1.0 3 d 0.9±0.1 0.9±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 5 d 1.5±0.1 1.2±0.1 1.3±0.2 1.1±0.1 7 d 10.2±1.0 10.6±1.2 9.2±1.8 7.4±0.8 9 d 32.8±8.2 34.4±6.5 26.9±6.2 23.9±5.5 11 d 54.3±6.0 59.5±10.3 46.2±5.0 43.6±6.3 14 d 156.4±18.2 160.2±28.4 126.1±19.8 110.4±11.3

2.3 流式表型

2.3.1 PBMC凍存前后細(xì)胞表型變化 A、B、C組PBMC復(fù)蘇后，與F組相比，淋巴細(xì)胞表型沒有明顯差異（P＞0.05），見表3。

表3 PBMC凍存前后淋巴細(xì)胞表型比較（±s，n=3，%）

表3 PBMC凍存前后淋巴細(xì)胞表型比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組CD3+ 67.7±5.8 67.4±7.0 66.0±5.2 65.8±4.4 CD3+CD4+ 31.5±7.3 31.3±7.0 30.3±5.7 28.0±3.9 CD3+CD8+ 33.7±0.6 34.7±0.6 34.2±0.6 34.6±1.1 CD3+CD56+ 4.7±1.8 4.7±2.6 4.1±2.3 4.6±2.1 CD3-CD56+ 15.6±3.8 14.9±2.2 13.7±2.3 14.7±2.1

2.3.2 凍存前后培養(yǎng)過程中細(xì)胞表型變化 CD3+，CD3+ CD8+，CD3+CD4+，CD3+CD56+，CD3-CD56+細(xì)胞比較，4組細(xì)胞培養(yǎng)14 d，A/B/C組與F組相比，CD3+，CD3+CD8+，CD3+CD4+，CD3+CD56+，CD3-CD56+的比例均無明顯差異，見表4-8。

CIK細(xì)胞體外殺傷作用比較。4組細(xì)胞培養(yǎng)14 d，A/B/C組與F組對(duì)比，對(duì)K562細(xì)胞體外殺傷無明顯差異，見表9，圖1。

表4 PBMC凍存前后CD3+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

表4 PBMC凍存前后CD3+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 67.7±5.8 67.4±7.0 66.0±5.2 60.9±4.4 7 d 95.4±2.0 96.2±2.0 96.4±1.2 97.4±2.0 14 d 96.3±2.1 96.9±1.5 96.7±1.3 98.8±2.7

表5 PBMC凍存前后CD3+CD8+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

表5 PBMC凍存前后CD3+CD8+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 33.7±0.6 34.1±1.4 33.6±0.5 32.1±3.5 7 d 69.6±10.5 69.5±9.9 68.9±11.3 70.3±9.4 14 d 72.9±6.3 74.3±8.3 72.1±8.3 71.1±6.8

表6 PBMC凍存前后CD3+CD4+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

表6 PBMC凍存前后CD3+CD4+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 31.5±7.7 31.3±7.0 30.3±5.7 28.0±3.9 7 d 38.5±9.3 36.0±9.9 40.7±2.4 38.2±6.6 14 d 29.3±4.9 32.1±4.1 33.2±3.3 29.8±4.8

表7 PBMC凍存前后CD3+CD56+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

表7 PBMC凍存前后CD3+CD56+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 4.7±1.8 4.7±2.6 4.1±2.3 4.6±2.1 7 d 7.7±0.7 7.4±0.8 7.8±0.5 7.2±0.4 14 d 13.9±3.2 12.3±0.5 13.4±2.6 12.9±2.8

表8 PBMC凍存前后CD3-CD56+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

表8 PBMC凍存前后CD3-CD56+細(xì)胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 15.6±3.8 14.9±2.2 13.7±2.3 14.7±2.1 7 d 3.3±2.2 2.9±2.0 3.0±1.6 2.6±2.0 14 d 1.8±1.1 1.6±0.8 1.6±0.6 1.6±1.1

表9 CIK細(xì)胞殺傷作用比較（±s，n=3）

表9 CIK細(xì)胞殺傷作用比較（±s，n=3）

組別 殺傷率/%F組 48.5±5.7 A組 49.5±4.9 B組 47.8±4.9 C組 44.7±2.7

圖1 CIK細(xì)胞殺傷作用比較

3 討論

近年來，隨著細(xì)胞銀行及細(xì)胞庫廣泛開展，對(duì)細(xì)胞凍存技術(shù)的要求也越來越嚴(yán)格。細(xì)胞凍存的質(zhì)量直接決定了細(xì)胞復(fù)蘇后的應(yīng)用。目前尚未見凍存密度對(duì)PBMC功能影響的文獻(xiàn)報(bào)道，偶見細(xì)胞系或其他體細(xì)胞對(duì)凍存密度的敏感性文獻(xiàn)［16-18]。通過CIK方式培養(yǎng)PBMC，可在一定程度上驗(yàn)證凍存對(duì)PBMC功能的影響［19]。本研究通過設(shè)置不同PBMC凍存密度，并通過凍存PBMC與新鮮PBMC CIK培養(yǎng)效果對(duì)比，來驗(yàn)證凍存密度對(duì)PBMC功能的影響。3個(gè)樣品（Donor A、Donor B和Donor C）的3個(gè)不同凍存密度細(xì)胞復(fù)蘇后再進(jìn)行CIK培養(yǎng)，其中2.0×107/mL凍存密度組與新鮮組相比，誘導(dǎo)CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較無明顯差異，甚至高于未凍存細(xì)胞；而4.0×107/mL和6.0×107/mL兩個(gè)密度凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后誘導(dǎo)ECIK細(xì)胞培養(yǎng)14 d，擴(kuò)增倍數(shù)與未凍存細(xì)胞相比擴(kuò)增倍數(shù)有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從活率來看，2.0×107/mL凍存密度組與新鮮組相比，活率無明顯差異，而4.0×107/mL和6.0×107/mL兩個(gè)密度凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后活率與新鮮組相比活率有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

3種不同密度凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后流式表型檢測(cè)結(jié)果與新鮮PBMC相比，無明顯差異，且凍存細(xì)胞與新鮮PBMC對(duì)比，經(jīng)過誘導(dǎo)CIK細(xì)胞培養(yǎng)后，流式表型也無明顯差別，說明凍存對(duì)PBMC的表型和功能沒有影響。另外，3份樣品凍存前后培養(yǎng)CIK細(xì)胞14 d后體外殺傷作用檢測(cè)結(jié)果也無明顯差異。

Kawai等［20]在1988年的研究中認(rèn)為，凍存后的PBMC（凍存密度為2.0×107/mL，凍存時(shí)間12個(gè)月）與新鮮組相比，淋巴細(xì)胞亞群比例無明顯變化，但誘導(dǎo)為LAK細(xì)胞及NK細(xì)胞后，對(duì)k562、Raji等腫瘤細(xì)胞體外殺傷效率較低，可能與其凍存劑的種類影響有關(guān)。

過高的PBMC凍存密度會(huì)影響其凍存效果而間接影響細(xì)胞的復(fù)蘇應(yīng)用，而過低的凍存密度因?yàn)樵黾觾龃骟w積而大大提高凍存成本，這兩點(diǎn)都是大樣本量細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行要考慮到的問題。本實(shí)驗(yàn)通過CIK擴(kuò)增方法證明了2.0×107/mL、4.0×107/mL、6.0×107/mL三個(gè)凍存密度對(duì)PBMC的影響，本實(shí)驗(yàn)研究人員將在未來的實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大凍存密度驗(yàn)證范圍以及用更多的PBMC應(yīng)用（培養(yǎng)）方法從多角度證明實(shí)驗(yàn)觀點(diǎn)。

4 結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)可以看出，3個(gè)凍存密度對(duì)PBMC的表型及進(jìn)行CIK培養(yǎng)后對(duì)K562的體外殺傷效率無影響，但4.0×107和6.0×107兩個(gè)凍存密度對(duì)PBMC復(fù)活的活率及CIK培養(yǎng)的擴(kuò)增率有顯著影響。

由此可見，采用2.0×107密度凍存的細(xì)胞凍存后培養(yǎng)效果較好，且與未凍存細(xì)胞相比無明顯差異，均能達(dá)到制備需求，而采用4.0×107和6.0×107密度凍存后細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均與未凍存細(xì)胞有一定差異，因此，選擇2.0×107密度進(jìn)行凍存效果較好。