陳相好 劉芳 王彩霞 陳崢宏，3 洪偉 蔡夢迪 張崢嶸，3綦廷娜，3 廖永慧 谷俊瑩 崔古貞，3

（1. 貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽 550004；2. 貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴陽 550025；3. 貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室，貴陽 550025；4. 貴州醫(yī)科大學分子生物學重點實驗室，貴陽 550004；5. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴陽 550004）

II型內(nèi)含子（Group II Intron）是在細菌、古細菌及高等植物細胞器（線粒體、葉綠體）中發(fā)現(xiàn)的一類核酶，由內(nèi)含子RNA和內(nèi)含子編碼蛋白（Intron Encoded Protein，IEP）組成［1-4]。其中，內(nèi)含子RNA具有核酶活性，通過堿基互補配對原則識別雙鏈DNA；IEP具有反轉(zhuǎn)錄酶和DNA核酸內(nèi)切酶活性，與內(nèi)含子RNA組裝為核糖核蛋白復合體，維持內(nèi)含子RNA的空間結構，輔助內(nèi)含子RNA識別靶位點，并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性切割靶位點，而且IEP能以內(nèi)含子RNA為模板合成cDNA，從而將內(nèi)含子RNA以DNA形式插入到染色體靶位點，實現(xiàn)內(nèi)含子 RNA 的“歸巢”［5-9]（圖 1）。

圖1 II型內(nèi)含子的“歸巢”示意圖

來源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的Ll.LtrB內(nèi)含子因其較高的“歸巢”效率，已被開發(fā)為高效Targetron基因打靶系統(tǒng)，并在革蘭陽性細菌（如丙酮丁醇梭菌、解纖維梭菌、艱難梭菌、金黃色葡萄球菌）［10-16]和革蘭陰性細菌（如大腸桿菌、綠膿桿菌和根癌農(nóng)桿菌）［17]等多個細菌中獲得廣泛應用，尤其適用于難改造的革蘭氏陽性厚壁細菌，如肉毒梭菌、艱難梭菌和解纖維梭菌等。該技術在梭菌中也稱為Clos tron技術［6]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，II型內(nèi)含子的表達方式對Targetron系統(tǒng)的打靶效率及打靶精度具有很大的影響［18]。如來源于pSY6的Targetron系統(tǒng)，因其II型內(nèi)含子的表達是受ptb組成型啟動子調(diào)控，II型內(nèi)含子在細胞內(nèi)長期大量存在，使其在解纖維梭菌中存在一定的脫靶現(xiàn)象。當把組成型啟動子更換為阿拉伯糖誘導型啟動子后，因其表達量和表達模式可以根據(jù)需要隨時受到調(diào)控，其脫靶現(xiàn)象大幅度降低［18]。因此，構建不同的誘導型Targetron系統(tǒng)可以提高其打靶效果。

本研究將來源于Ll.LtrB的II型內(nèi)含子置于T7-lac操縱子控制之下，構建了IPTG誘導型Targetron質(zhì)粒，并通過優(yōu)化誘導劑濃度和誘導時間，在大腸桿菌中建立了誘導型Targetron體系，旨為II型內(nèi)含子的機理研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）均用37℃在LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，LB液體培養(yǎng)基的配制：1% TRYPTONE、0.5% YEAST EXTRACT、1% NaCl，在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%的Agar Powder成為LB固體培養(yǎng)基。質(zhì)粒構建及II型內(nèi)含子誘導表達所用氨芐青霉素的篩選濃度為100 μg/mL，藍白斑篩選時，在LB固體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素（100 μg/mL）、X-gal（40 μg/mL）和 IPTG（0.1 mmol/L）。

1.1.2 主要試劑 高保真DNA聚合酶、DNA marker、T4 DNA連接酶購自北京全式金生物技術有限公司，Taq DNA 聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific，Gibson組裝試劑盒購自NEB，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司，IPTG、X-gal、氨芐青霉素購自北京索萊寶公司，引物合成及測序由上海生工完成。

1.1.3 引物 本研究所用到的引物詳見表1。

1.1.4 菌株及質(zhì)粒 本研究中用的菌株及質(zhì)粒詳見表2。

表1 本研究所用到的引物

表2 本研究所用到的菌株及質(zhì)粒

1.2 方法

1.2.1 打靶引物設計 以大腸桿菌lacZ基因為靶基因，利用在線網(wǎng)址（www.clostron.com），結合評分高低，選擇lacZ基因正義鏈第635位點（lacZ-635s）和反義鏈第1063位點（lacZ-1063a）作為打靶位點，每個打靶位點軟件會給出4種引物（IBS、EBS1d、EBS2、EBS Universal），設計獲得的引物序列詳見表1。

1.2.2 IPTG誘導的Targetron打靶質(zhì)粒構建 以pET28a載體為模板，lacI-T7-F和lacI-T7-R為引物，PCR擴增lacI-T7片段。利用Gibson組裝試劑盒將lacI-T7擴增產(chǎn)物與XmaI/XhoI雙酶切的pSY6載體組裝，獲得IPTG誘導型Targetron載體pSY7（圖2）。

通過重疊延伸PCR方法構建內(nèi)含子RNA打靶識別片段，用XhoI和BsrGI雙酶切PCR產(chǎn)物和pSY7質(zhì)粒，T4 DNA連接酶連接得到兩個位點的特異性打靶質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a，詳細構建流程如圖2所示。

1.2.3 大腸桿菌BL21（DE3）的轉(zhuǎn)化 利用熱激法將質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞，置于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。

1.2.4 IPTG濃度對Targetron打靶效率的影響 取40 μL過夜培養(yǎng)的菌液加入到4 mL的LB液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃、200 r/min培養(yǎng)1 h，加入不同終濃度的IPTG置于37℃、200 r/min培養(yǎng)45 min，離心收集細胞沉淀，稀釋后涂布LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），37℃過夜培養(yǎng)，通過藍白斑計數(shù)計算其打靶效率。

1.2.5 誘導時間對Targetron打靶效率的影響 加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG進行不同時間的誘導，通過藍白斑計數(shù)計算其打靶效率，其余操作同1.2.4。

2 結果

2.1 IPTG誘導的Targetron質(zhì)粒構建

IPTG誘導的pSY7質(zhì)粒詳細構建流程如圖1所示。pSY7質(zhì)粒經(jīng)XmaI/XhoI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見清晰的約1.7 kb大小的電泳條帶（圖3），與預期結果一致，表明誘導型Targetron質(zhì)粒構建成功。

圖3 質(zhì)粒pSY7酶切驗證及瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.2 lacZ-635s和lacZ-1063a位點的打靶質(zhì)粒構建

利用重疊延伸PCR方法，以設計的lacZ-635s和lacZ-1063a兩個位點的特異引物為引物，以Targetron載體指導RNA序列為模板，擴增lacZ-635s和lacZ-1063a兩個位點的特異性打靶片段。圖4-A表示第一輪PCR擴增結果，瓊脂糖凝膠電泳顯示，分別獲得打靶序列上游約0.25 kb和下游約0.1 kb的片段；圖4-B表示第二輪PCR擴增結果，瓊脂糖凝膠電泳顯示獲得0.35 kb特異性條帶。然后，分別用XhoI/BsrGI雙酶切第二輪PCR產(chǎn)物和pSY7載體，T4 DNA連接酶連接后獲得特異性打靶載體pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a。雙酶切驗證與預期結果一致（圖4-C）；最后，通過測序進一步證實兩個位點的打靶載體均構建成功。

圖4 Targetron載體構建及酶切驗證

2.3 IPTG誘導型Targetron打靶系統(tǒng)嚴謹性分析及功能驗證

將打靶質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），復蘇后直接涂布LB平板，過夜培養(yǎng)后分別挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果表明，未經(jīng)誘導的Targetron質(zhì)粒涂平板后獲得的菌落均是野生型，表明本研究構建的Targetron系統(tǒng)具有較好的嚴謹性。

同時，進行平行試驗，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌首先經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導1 h，稀釋后涂布LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素 100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），過夜培養(yǎng)后，分別挑取平板上的白色菌落和藍色菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖5所示：當用打靶位點上下游引物進行PCR擴增驗證時，突變株得到約1.9 kb的PCR擴增條帶，而野生型對照菌株得到約1.0 kb的PCR擴增條帶（圖5-B）。當利用插入序列的內(nèi)側引物和外側引物進一步進行PCR驗證時，兩種突變株均得到0.65 kb和1.6 kb的PCR擴增條帶（圖5-C）?？傊?，上述結果表明，本研究成功構建IPTG誘導型Targetron打靶系統(tǒng)。

圖5 Targetron基因打靶系統(tǒng)的功能驗證

2.4 IPTG濃度對打靶效率的影響

質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），使用不同濃度的IPTG分別誘導45 min。結果（圖6）顯示，在沒有IPTG誘導時，兩種質(zhì)粒的打靶效率均為0，隨著IPTG濃度的提高，其歸巢效率也逐步提高，當IPTG濃度達到0.5 mmol/L時，兩種質(zhì)粒的打靶效率達到最高值，達到90%以上。

圖6 IPTG濃度對歸巢效率的影響

2.5 IPTG誘導時間對打靶效率的影響

質(zhì)粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L的IPTG分別誘導15 min、30 min、45 min、60 min。如圖7所示，兩種質(zhì)粒的打靶效率隨著誘導時間的增加而增加，當誘導時間達到45 min時，兩種質(zhì)粒的打靶效率達到最大值。

圖7 誘導時間對歸巢效率的影響

3 討論

來源于乳酸乳球菌的LtrB內(nèi)含子，在內(nèi)含子編碼蛋白的輔助下，成為高效可移動的元件。由于II型內(nèi)含子通過IEP及內(nèi)含子RNA共同識別目標DNA序列，利用Targetron在線設計網(wǎng)址找到潛在內(nèi)含子識別位點，結合PCR技術對內(nèi)含子RNA修飾改造，從而實現(xiàn)內(nèi)含子RNA的特異性“歸巢”，基于此建立的基因打靶技術被廣泛應用于原核生物的遺傳改造，展現(xiàn)了可觀的應用前景。有研究人員借助Targetron技術得以在包含毒性因子［19-21]、潛在藥物靶點［22-23]等方面深入研究。選擇Targetron設計網(wǎng)址得到的較高得分的潛在插入位點，可防止II型內(nèi)含子的脫靶，并且不需要遺傳篩選標記，通過克隆PCR能輕易地篩選到突變菌株。

然而，無論在何種微生物中應用，II型內(nèi)含子的長期表達和大量積累均會降低其打靶精度，不利于其后續(xù)的遺傳篩選。本研究建立的IPTG誘導型基因打靶系統(tǒng)，利用T7-lac操縱子與內(nèi)含子組裝，實現(xiàn)了Targetron系統(tǒng)在大腸桿菌中的可控誘導表達，而且可以根據(jù)需要，調(diào)控Targetron系統(tǒng)的表達模式，如在何時需要II型內(nèi)含子表達、II型內(nèi)含子的表達的強度是多少等，從而實現(xiàn)對靶基因的精確調(diào)控。

目前常用的基因打靶技術如基于同源重組原理的RecA系統(tǒng)和Red系統(tǒng)，其重組效率較低，需要進行多次轉(zhuǎn)化和篩選方可獲得突變株，實驗周期較長［24]。基于DNA斷裂損傷、激發(fā)機體修復機制的基因編輯方法如鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）技術和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸 酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術，該技術具有靶向精確、細胞毒性低等優(yōu)勢，已在多個物種中獲得廣泛應用。然而，該技術均以蛋白作為向?qū)?，需要構建復雜的載體系統(tǒng)，技術難度較大，成本較高［25]。此外，CRISPRCas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9 system）技術是目前應用最廣泛的基因編輯技術，該技術以RNA為向?qū)В瑑H需改變約20 bp的RNA序列即可實現(xiàn)不同基因的打靶，具有效率高、成本低、操作方便等優(yōu)勢，但仍存在一定的脫靶風險［25]。本研究中采用的Targetron基因打靶技術是基于細菌II型內(nèi)含子的“歸巢”原理而設計，該技術以內(nèi)含子RNA為向?qū)?，通過改變內(nèi)含子RNA的序列實現(xiàn)不同基因的打靶，具有效率高，操作方便等優(yōu)勢，尤其適用于微生物的遺傳改造。本研究將T7-lac操縱子與Targetron基因打靶系統(tǒng)聯(lián)合，成功構建誘導型Targetron系統(tǒng)，極大地縮短了實驗周期，提高了工作效率。

本研究中建立的方法由于采用的是T7-lac操縱子啟動內(nèi)含子RNA及內(nèi)含子編碼蛋白的表達，而T7啟動子需要和T7 RNA聚合酶相互識別才能發(fā)揮功能，并且在不同的微生物中，需要不同的復制元件，故本研究建立的方法限于編碼T7 RNA聚合酶的大腸桿菌系統(tǒng)。但是通過在質(zhì)粒上構建T7 RNA聚合酶的序列及更換合適的復制元件，便可用于其他微生物的遺傳改造?？傊?，本研究建立的誘導型Targetron技術，為II型內(nèi)含子的功能應用與機理研究奠定了基礎。

4 結論

本研究將T7-lac操縱子與II型內(nèi)含子組裝得到了大腸桿菌IPTG誘導型Targetron基因打靶系統(tǒng)，利用克隆PCR，驗證了其具有嚴謹表達的優(yōu)點，并通過優(yōu)化誘導條件，提高了基因打靶的效率。

致謝：

感謝中國科學院上海生命科學院植物生理生態(tài)研究所姜衛(wèi)紅課題組提供pSY6質(zhì)粒。