李 旺 史敦勝 丁 軻 曹平華 趙龍妹

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的劇毒物質(zhì)[1]，主要由曲霉菌屬的黃曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌在一定的環(huán)境條件下生物合成的次級代謝產(chǎn)物[2-3]，具有強(qiáng)烈的致畸、致癌和致突變作用[4-5]。AFT是各種糧食、食品和飼料中廣泛存在的一類霉菌毒素，對全世界人類和動物的健康構(gòu)成極大的威脅[6-8]。近年來微生物及其產(chǎn)生的分解酶對AFT進(jìn)行生物抑制和降解的方法陸續(xù)被報道，其中黃曲霉毒素分解酶(Aflatoxin-detofizyme，ADTZ)是特異性分解黃曲霉毒素的活性物質(zhì)[9-12]。但天然黃曲霉毒素分解酶，難以從菌株中分離，不同微生物菌種對AFT的降解作用機(jī)理還不明確，酶的活性不高，大部分對標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素B1(AFB1)具有分解效果[9,13]，而所篩選的酶對天然谷物等感染的黃曲霉毒素分解研究甚少。利用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)將ADTZ基因克隆，并在異源宿主中進(jìn)行表達(dá)，可以獲得明確的分解酶產(chǎn)物，提高ADTZ的產(chǎn)量和活性[14]。

本研究擬通過已報道[15]的ADTZ序列合成引物，擴(kuò)增ADTZ基因，在大腸桿菌中融合表達(dá)，驗證ADTZ基因是否可以進(jìn)行異源表達(dá)，同時檢測表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)量并應(yīng)用到對谷物中黃曲霉毒素的分解上，以期獲得更高活性的ADTZ，對天然谷物中黃曲霉毒素的生物降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒菌種

質(zhì)粒pGEM-Teasy：美國Promega公司；

質(zhì)粒pMAL-c5x、大腸桿菌Rosetta(DE3)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

大腸桿菌(E.coliDH5ɑ)：本實驗室保存；

混合菌種混懸液：本實驗經(jīng)發(fā)霉玉米制備，用以擴(kuò)增ADTZ目的基因。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker：天根生化科技(北京)有限公司；

黃曲霉毒素B1ELISA檢測試劑盒：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；

非預(yù)染蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker：生工生物工程(上海)股份有限公司；

NcoI、BamHI、DNA聚合酶(500 U)、DNA連接酶(100 U)：美國Promega公司。

1.1.3 主要設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9272BS型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

恒溫培養(yǎng)搖床：SKY-2102型，上海蘇坤實業(yè)有限公司；

冷凍離心機(jī)：Thermo Micro 21R型，美國Thermo Electron Corporation公司；

電泳儀：JY600C型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Tanon 4600SF型，上海天能科技有限公司；

酶標(biāo)儀：DNM-9606型，北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合菌種混懸液制備 稱取200 g發(fā)霉玉米，破碎后置于500 mL燒杯中，加入20 mL蒸餾水，用塑料袋封住燒杯口，室溫條件下放置14 d，待霉菌菌絲長出，取表面10 g發(fā)霉玉米，加入30 mL的蒸餾水，用渦旋震蕩器震蕩5 min，經(jīng)3層紗布過濾雜質(zhì)，取180 μL的濾液沸水浴5 min后，加入20 μL的溶菌酶，在37 ℃水浴30 min。

1.2.2 目的基因的TA克隆與鑒定 以處理過的發(fā)霉玉米混合菌液為模板，利用表1中合成的引物(上游引物含NcoI酶切位點，下游引物含BamH I酶切位點)，55 ℃退火溫度擴(kuò)增ADTZ基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，對重組菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒命名pGEM-Teasy-ADTZ，并用NcoI、BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定。序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 目的基因引物信息Table 1 The primers of objective gene

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 分別對重組質(zhì)粒pGEM-Teasy-ADTZ、質(zhì)粒PMAL-c5x用NcoI、BamH I進(jìn)行雙酶切，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。用T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中，涂板在培養(yǎng)皿上形成單菌落。挑取陽性克隆菌落，提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序，將重組的質(zhì)粒命名為pMAL-c5x-ADTZ。

1.2.4 ADTZ基因的誘導(dǎo)表達(dá)及分析 挑取含pMAL-c5x-ADTZ質(zhì)粒的Rosetta(DE3)菌落于含10 mL的LB培養(yǎng)基的大試管中，37 ℃，220 r/min搖床過夜擴(kuò)大培養(yǎng)；將培養(yǎng)的菌液按體積比1∶100比例分別接種于8個裝液100 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，添加Amp(1 μg/mL)溶液，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)約2 h，當(dāng)菌液OD值達(dá)到0.6～0.8時，在4個搖瓶中分別添加終濃度為1 mmol/mL的IPTG，并將4個三角瓶分2組，2瓶于25 ℃，220 r/min振搖誘導(dǎo)過夜；另2瓶于37 ℃，220 r/min 振搖誘導(dǎo)4 h。未加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的4個搖瓶菌種按照同樣的接種流程分別在25，37 ℃培養(yǎng)。對所有菌液進(jìn)行低溫離心收集菌體和上清液，菌體進(jìn)行超聲波破碎，然后將破碎的菌體和上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 ADTZ粗酶液降解玉米AFB1試驗

(1)粗酶液的制備：將含pMAL-c5x-ADTZ質(zhì)粒的Rosetta(DE3)菌液活化，加入IPTG，220 r/min，37 ℃誘導(dǎo)過夜培養(yǎng)；離心收集菌體，用10倍PBS緩沖液重懸超聲波破碎后，即為粗酶液。

(2)降解試驗：稱取5 g發(fā)霉玉米樣品置于25 mL的小燒杯中，121 ℃滅菌20 min。取5 mL的ADTZ粗酶液，加入到發(fā)霉的玉米樣品中，攪拌均勻，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)48 h，在65 ℃條件下烘干樣品備測。對照組將ADTZ粗酶液煮沸滅活，同樣操作，對照組和試驗組各3個重復(fù)樣品。

(3)黃曲霉毒素檢測：取樣品5 g，加入60%甲醇25 mL 萃取AFB1；3 000 r/min離心10 min，取上清 1 mL 萃取液，再加入4 mL去離子水，稀釋至甲醇濃度12%的待測液(樣品共稀釋25倍)。按照ELISA 檢測試劑盒說明書操作方法測定樣品AFB1的含量。按式(1)計算AFB1降解率。

(1)

式中：

d——降解率，%；

c——對照組AFB1含量，μg/kg；

t——試驗組AFB1含量，μg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADTZ序列的克隆與序列分析

以發(fā)霉玉米提取的混合菌液為模板，對ADTZ序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示成功擴(kuò)出了大于2 100 bp 大小目的的條帶，如圖1(a)泳道1、2、3。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-Teasy進(jìn)行連接，提取重組質(zhì)粒，命名為pGEM-Teasy-ADTZ，對其進(jìn)行NcoI、BamH I雙酶切鑒定，酶切后獲得兩條目的條帶，其中一條約為3 000 bp，另一條約為2 100 bp，與PCR擴(kuò)增結(jié)果和載體大小一致，如圖1(b)所示。將質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果表明該基因片段大小為2 088 bp，連續(xù)編碼695個氨基酸。在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站上的BLAST比對，結(jié)果顯示，該基因與NCBI網(wǎng)站公布報道的黃曲霉毒素分解酶基因(gene ID:AY941095.1)序列[15]相似性達(dá)到99%(見圖2)，整個序列中有3處共9個堿基與已報道[15]的黃曲霉基因堿基不同，說明已成功從發(fā)霉玉米混懸菌液中克隆得到黃曲霉毒素分解酶基因。

圖1 ADTZ基因的PCR擴(kuò)增和酶切鑒定Figure 1 PCR amplification and identification of the ADTZ sequence

已知的ADTZ基因來源于真菌假密環(huán)菌(Armillariellatabescens)[15]，但也有報道[9-12]表明，很多微生物具有降解黃曲霉毒素的能力。本試驗中ADTZ基因，是從發(fā)霉玉米中提取的混合菌液中擴(kuò)增得到，且與黃曲霉毒素分解酶(ADTZ)基因序列相似性達(dá)到99%。結(jié)合李俊霞等[16]從發(fā)霉飼料中篩選出兩株降解AFB1菌株的試驗結(jié)果，推測發(fā)霉玉米中不僅含有能夠產(chǎn)生AFT的微生物，同時也具有能夠降解黃曲霉毒素的微生物的存在。其可能為較高濃度的毒素作為一種選擇壓力，能夠降解AFT菌株更容易生存。在模板不明確的條件下，從混合菌液中成功獲得ADTZ基因，表明PCR探針能夠有效地篩選出目的基因。與常規(guī)的PCR技術(shù)進(jìn)行比較，利用菌液PCR技術(shù)篩選目的基因快速靈敏，成本較低，是獲得目的基因片段的有效途徑[17]。

方框內(nèi)ADTZ堿基序列與已報道的黃曲霉基因(AY941095.1)堿基不同圖2 ADTZ序列分析與比對Figure 2 Analysis and alignment of ADTZ sequences

2.2 重組質(zhì)粒pMAL-c5x-ADTZ的構(gòu)建與鑒定

ADTZ基因片段經(jīng)NcoI、BamH I雙酶切后連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAL-c5x-ADTZ，該質(zhì)粒的各序列結(jié)構(gòu)圖譜如圖3所示。

挑取含有pMAL-c5x-ADTZ重組質(zhì)粒的陽性菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NcoI、BamH I雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示。質(zhì)粒酶切后獲得兩條DNA片段，其中一條與載體大小一致，約為5 700 bp，另一條與ADTZ目的基因大小一致，約為2 100 bp，表明目的基因成功連接到大腸桿菌表達(dá)載體上。

2.3 ADTZ基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將含有重組質(zhì)粒pMAL-c5x-ADTZ的大腸桿菌Rosetta(DE3)和宿主菌在25，37 ℃下培養(yǎng)，收集菌體和上清，對菌體破碎后進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在宿主大腸桿菌Rosetta(DE3)菌體蛋白中未出現(xiàn)于目的蛋白大小相當(dāng)?shù)臈l帶。在重組大腸桿菌的上清液和菌體蛋白中(泳道2～4)均可檢測到分子量約116 kDa 的蛋白條帶，與MBP標(biāo)簽和ADTZ蛋白兩者融合產(chǎn)生的蛋白分子量一致。其中菌體中的目的蛋白含量更多，37 ℃培養(yǎng)的細(xì)菌菌體中目的蛋白含量高于25 ℃培養(yǎng)，而上清液中目的蛋白含量相反。

圖3 重組質(zhì)粒pMAL-c5x-ADTZ模式圖Figure 3 Schematic diagram of the recombinant plasmid pMAL-c5x-ADTZ

DNA分子標(biāo)量從上到下依次為10 000，8 000，6 000，5 000，4 000，3 500，3 000，2 500，2 000，1 500，1 200，1 000，900，800，700，600，500，400，300 bp
圖4 質(zhì)粒PMAL-c5x-ADTZ的雙酶切鑒定
Figure 4 Identification of plasmid PMAL-c5x-ADTZ by double digestion

M.Protein Marker 1.Rosetta(DE3)總蛋白 2.25 ℃上清 3.25 ℃沉淀 4.37 ℃上清 5.37 ℃沉淀圖5 MBP-ADTZ融合蛋白SDS-PAGE檢測Figure 5 MBP-ADTZ fusion protein SDS-PAGE detection

對重組大腸桿菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖6所示。宿主Rosetta(DE3)誘導(dǎo)后無與目的蛋白大小一致的條帶出現(xiàn)；而其他4條泳道均有大小與目標(biāo)蛋白一致的蛋白條帶，其規(guī)律未進(jìn)行誘導(dǎo)的結(jié)果一致，表達(dá)的蛋白量高于未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株。進(jìn)一步驗證了ADTZ基因能夠在大腸桿菌中與MBP標(biāo)簽進(jìn)行了融合并表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大部分在細(xì)胞內(nèi)，受誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)。

pMALTM系統(tǒng)是一種高效的蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)，其中pMAL 載體含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)的基因，其下游插入目的基因，可利用 MBP 標(biāo)簽對麥芽糖的特異性，結(jié)合實現(xiàn)融合蛋白的一步親和純化[18]。其中MBP蛋白大小為40 kD，由大腸桿菌K12的malE基因編碼，具有表達(dá)效率高、蛋白穩(wěn)定、易于純化等優(yōu)點，能夠協(xié)助新生的多肽鏈折疊，并組裝成穩(wěn)定的有生物活性的結(jié)構(gòu)[19-20]。本試驗正是利用該表達(dá)系統(tǒng)的特點，進(jìn)行ADTZ基因的融合表達(dá)，并獲得了具有生物活性的表達(dá)產(chǎn)物。驗證了該系統(tǒng)的可靠性。

M.預(yù)染Protein Marker 1.誘導(dǎo)前總蛋白 2.25 ℃上清 3.25 ℃沉淀 4.37 ℃上清 5.37 ℃沉淀圖6 MBP-ADTZ誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖Figure 6 Induced expression electrophoresis of MBP-ADTZ

已報道[16,21]來源于假密環(huán)菌(Armillariellatabescens)的ADTZ基因，編碼合成的生物蛋白為假密環(huán)菌的胞內(nèi)酶，具有降解AFT的能力，能獨立完整地表達(dá)具有活性的ADTZ蛋白，并能夠在大腸桿菌以及酵母菌(Pichiapastoris)中表達(dá)[22-23]。溫思霞等[15]通過分子克隆技術(shù)，成功克隆并重組表達(dá)了一種具有AFB1轉(zhuǎn)化功能的黃曲霉毒素氧化酶(Aflatoxin-oxidase，AFO)，同時試驗推測ADTZ酶可能存在于其他能夠降解AFT的生物菌株中。本試驗擴(kuò)增的ADTZ基因與已有的報道，雖然同源性高達(dá)99%，但存在3處堿基的突變，通過構(gòu)建表達(dá)載體pMAL-c5x實現(xiàn)了黃曲霉毒素在大腸桿菌中的異源融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性，豐富了AFB1降解基因的種類。

2.4 AFDZ表達(dá)產(chǎn)物對玉米AFB1的分解

為了驗證ADTZ基因表達(dá)產(chǎn)物——黃曲霉毒素分解酶的酶活性，用其對發(fā)霉玉米的AFB1進(jìn)行分解試驗，結(jié)果如表2所示。對照組中AFB1測定結(jié)果平均值為27.97 μg/kg，試驗組中AFB1的平均值為6.24 μg/kg，AFB1平均降解率為77.69%。表明，ADTZ基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物能夠有效地降低天然發(fā)霉樣品中的AFB1的含量，更進(jìn)一步驗證了ADTZ基因結(jié)構(gòu)完整，能夠?qū)崿F(xiàn)異源表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)活性。

表2 表達(dá)產(chǎn)物對玉米AFB1的降解結(jié)果Table 2 Degradation of expressed products to maize AFB1

本試驗中重組菌粗酶液對黃曲霉毒素的降解率為77.69%，低于已報道的降解率(達(dá)到80%以上[24-25])。分析其原因可能：本試驗表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白，在降解功能上可能受到影響；本試驗測定的降解率為天然發(fā)霉玉米種的AFB1，與標(biāo)準(zhǔn)品AFB1比較，天然樣品的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，降解其中的AFB1難度更高。

3 結(jié)論

采用PCR的方法成功從發(fā)霉玉米樣品中擴(kuò)增到黃曲霉毒素分解酶基因，通過序列分析與已報道[15]的基因相似度達(dá)到99%，說明黃曲霉毒素分解酶基因廣泛存在于自然界的微生物菌種中，并豐富了黃曲霉毒素分解酶基因序列。通過構(gòu)建表達(dá)載體實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出了分解黃曲霉毒素的能力，說明可以通過異源表達(dá)獲得高純度的黃曲霉毒素分解酶。本研究使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)，后續(xù)的研究將集中在該基因產(chǎn)物的分離純化方面，以獲得純度較高的酶蛋白，并通過分子手段從基因水平對其進(jìn)行改造以提高表達(dá)產(chǎn)物分解天然黃曲霉毒素的效果。