焦 巖 韓 赫 常 影 李 沖 高建偉GAO Jian-wei

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米醇溶蛋白(Zein)來自于玉米淀粉加工的副產(chǎn)物玉米黃粉中[1]。Zein的氨基酸組成具有特殊性，因Zein分子中有 50%以上的疏水氨基酸使其具有兩親性，并具有獨(dú)特的自組裝特性。以Zein為載體不僅能夠通過包埋與載運(yùn)植物香精、功能油脂而提高功能性成分的穩(wěn)定性，而且能夠起到增加溶解性和控釋性等方面的作用。應(yīng)用反溶劑法可以制備Zein納米粒，其原理為利用溶劑的極性變化改變Zein的構(gòu)象，并輔助機(jī)械方法制備成納米結(jié)構(gòu)體系[2]。例如，Chuacharoen等[3]制備了玉米醇溶蛋白負(fù)載β-胡蘿卜素納米粒，提高了β-胡蘿卜素的化學(xué)穩(wěn)定性和在胃腸液環(huán)境下的抗氧化活性，效果優(yōu)于β-胡蘿卜素乳化液；玉米醇溶蛋白還可用于番茄精油的微膠囊壁材，可以防止番茄紅素在儲存過程中的降解，并防止番茄紅素在胃液環(huán)境中過多的釋放[4]；Hu等[5]采用超臨界二氧化碳法制備葉黃素/玉米醇溶蛋白納米粒，可對葉黃進(jìn)行有效包埋并顯示出良好的控釋效果。因此，玉米醇溶蛋白可以作為有效活性成分的載體，用于體內(nèi)外輸送和提高其穩(wěn)定性能。

葉黃素屬于類胡蘿卜素。葉黃素可以保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)免受光氧化，并減少年齡相關(guān)性黃斑變性疾病(AMD)，還可預(yù)防心腦血管疾病、減少輻射損傷和減少癌癥等多種疾病的發(fā)生[6-8]。但是葉黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易受到光、熱、氧化等作用而被降解，而且葉黃素水溶性低，不易被體內(nèi)消化吸收，限制了葉黃素在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[9]。

研究[10]表明，玉米醇溶蛋白可以與活性物質(zhì)通過自組裝作用形成納米復(fù)合物，改善穩(wěn)定性和生物活性。本試驗(yàn)擬通過玉米醇溶蛋白的載體作用將葉黃素進(jìn)行包埋與組裝，制備成納米結(jié)構(gòu)體系，并解析其結(jié)構(gòu)表征，旨在為拓展葉黃素在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素：純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司；

玉米醇溶蛋白：美國Sigma公司；

無水乙醇、石油醚、NaH2PO4、Na2HPO4：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

透射電子顯微鏡：F30型，美國FEI公司；

粒徑分析儀：Nano-Zs90型，德國新帕泰克有限公司；

電子天平：JA2003型，上海良平儀器儀表有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE2000E型，西安太康生物科技有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV2450型，日本島津公司；

磁力加熱攪拌器：CJJ-931型，常州萬達(dá)升實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

微型旋渦混合器：WXH型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum One型，美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒(Zein-Lutein)的制備 采用反溶劑法制備Zein-Lutein納米粒[11]。將葉黃素晶體加入到85%乙醇溶液中超聲溶解得到葉黃素原液，取等體積的玉米醇溶蛋白乙醇溶液按一定比例混合，將葉黃素原液和玉米醇溶蛋白混合溶液磁力攪拌混合均勻，然后在3 000 r/min下離心5 min，取上清液注入到等體積磷酸鹽緩沖液中，調(diào)整pH并在一定溫度下攪拌水合，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。

1.3.2 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及含量的測定 將梯度濃度的葉黃素制備成標(biāo)準(zhǔn)液，在最大吸收波長445 nm處測定吸光值，制作葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

經(jīng)過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到葉黃素的含量與吸光值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.176 3x+0.004 4(R2=0.999 1)。表明葉黃素的含量與吸光值呈良好的線性關(guān)系[12]。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of Lutein

1.3.3 包封率的測定 取3.0 mL上述方法制備的Zein-Lutein溶液，加入3 mL石油醚震蕩混勻1.0 min，在3 000 r/min 離心轉(zhuǎn)速下離心5.0 min，重復(fù)試驗(yàn)操作3次，回收上清溶液在445 nm處測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葉黃素溶液濃度，并根據(jù)式(1)計(jì)算包封率[13-14]。

(1)

式中：

EE——包封率，%；

C——黃素溶液濃度，μg/mL；

M——葉黃素總量，μg；

V——Zein-Lutein納米粒的總體積，mL。

再者，農(nóng)村小學(xué)的語文師資條件也是有限的，大多孩子小學(xué)畢業(yè)后，連漢語拼音都不過關(guān)，更別說其他方面的語文能力了。于是乎，這樣的語文學(xué)習(xí)能力，便直接影響了對初中語文的學(xué)習(xí)。

1.3.4 玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒 (Zein-Lutein)制備單因素試驗(yàn)

(1)水合時間對Zein-Lutein制備效果的影響：將玉米醇溶蛋白與葉黃素按質(zhì)量比20∶1混合均勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液注入到等體積pH 4.0磷酸鹽緩沖液中，在50 ℃下攪拌水合30，60，90，120，150，180 min，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。按上述方法測定包封率，研究水合時間對葉黃素包封率的影響。

(2)溫度對Zein-Lutein制備效果的影響：將玉米醇溶蛋白與葉黃素按質(zhì)量比20∶1混合均勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液注入到等體積pH 4.0磷酸鹽緩沖液中，在40，45，50，55，60，65 ℃下攪拌水合120 min，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。按上述方法測定包封率，研究溫度對葉黃素包封率的影響。

(3)玉米蛋白與葉黃素質(zhì)量比對Zein-Lutein制備效果的影響：將玉米醇溶蛋白與葉黃素分別按質(zhì)量比5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1混合均勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液注入到等體積pH 4.0磷酸鹽緩沖液中，在55 ℃下攪拌水合120 min，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。按上述方法測定包封率，研究玉米蛋白與葉黃素質(zhì)量比對葉黃素包封率的影響。

1.3.5 玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒制備正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取水合時間、溫度和玉米醇溶蛋白與葉黃素質(zhì)量比3個主要的影響因素，以包封率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別對Zein-Lutein納米粒制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.6 Zein-Lutein粒徑和電位的測定 取上述方法制備的Zein和Zein-Lutein樣品溶液，適當(dāng)調(diào)整濃度后取1.0 mL 置于Nano-90粒徑分析儀樣品池中進(jìn)行分析，得到Zein和Zein-Lutein的粒徑和電位分布圖譜[15]。

1.3.7 透射電子顯微鏡(TEM)觀察 通過TEM觀測Zein和Zein-Lutein納米顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。將2 μL樣品放置在具有碳膜的400目的銅格柵上，并用紅外燈烘干載Zein和Zein-Lutein納米顆粒的銅格柵，15 min后通過TEM進(jìn)行觀察其形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)[16]。

1.3.8 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析 將葉黃素和Zein-Lutein納米樣品溶液在真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥。收集干燥樣品在FT-IR中壓片，在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍測定紅外光譜，并對不同樣品的紅外光譜圖進(jìn)行分析比較[17]。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 10.0和Excel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zein-Lutein納米粒的制備單因素試驗(yàn)

2.1.1 水合時間對Zein-Lutein制備效果的影響 由圖2可以看出，隨著水合時間的延長，Zein與Lutein結(jié)合程度增加，導(dǎo)致對葉黃素包封率增大，Zein與Lutein充分水合120 min后形成的納米粒對葉黃素的包封率達(dá)到最大，且能夠均勻分散在水中形成納米分散體系，當(dāng)水合時間繼續(xù)增加時，包封率趨于平穩(wěn)，因此水合時間120 min時效果最佳。

圖2 水合反應(yīng)時間對包封率的影響Figure 2 Effects of hydrolyzed reaction time on entrapment efficiency

2.1.2 溫度對Zein-Lutein制備效果的影響 由圖3可以得出，隨著制備溫度升高Zein對Lutein包封率增大，在40～55 ℃時增加的趨勢比較明顯，當(dāng)溫度超過55 ℃時包封率變化呈下降趨勢。因?yàn)閆ein在加熱的條件下對Lutein能夠較好包埋形成納米結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度超過55 ℃時，蛋白質(zhì)開始變性且容易聚集，且高溫會導(dǎo)致葉黃素發(fā)生損失，使得對葉黃素的包封率下降，因此55 ℃為最適溫度。

圖3 制備溫度對包封率的影響Figure 3 Effects of prepared temperature on entrapment efficiency

2.1.3 玉米蛋白與葉黃素質(zhì)量比對Zein-Lutein制備效果的影響 由圖4可知，隨著Zein與Lutein的質(zhì)量比增大，葉黃素包封率增大，質(zhì)量比為15∶1時包封率達(dá)到最高，當(dāng)Zein用量繼續(xù)增加時，包封率不再增加，是因?yàn)檫^量的Zein在溶液中容易聚集，導(dǎo)致對Lutein包封效率略有下降，因此Zein與Lutein質(zhì)量比為15∶1時效果最佳。

圖4 玉米蛋白與葉黃素質(zhì)量比對包封率的影響Figure 4 Effects of Zein and Lutein ratio on entrapment efficiency

2.2 正交試驗(yàn)

按上述方法進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化Zein-Lutein制備的最佳條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果如表1和表2所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 The orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array experimental results

從表2可知，玉米醇溶蛋白對葉黃素包封率影響因素大小順序?yàn)镃(玉米醇溶蛋白與葉黃素質(zhì)量比)>A(水合時間)>B(溫度)，最優(yōu)組合為A2B1C2。將A2B1C組合進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的平均包封率為80.23%，小于正交試驗(yàn)A3B1C3組合中的81.0%，說明A3B1C3組合優(yōu)于A2B1C2組合。因此可確定玉米醇溶蛋白與葉黃素質(zhì)量比為20∶1，水合時間150 min，水合溫度50 ℃條件下玉米醇溶蛋白對葉黃素的包封率最大，制備效果最佳。

2.3 Zein-Lutein粒徑和電位分析

2.3.1 Zein-Lutein粒徑分析 采用Nano-Zs 90粒徑分析儀測得Zein和Zein-Lutein的粒徑大小分布如表3所示，可以看出Zein粒徑大小分布，顆粒度大小在171.0～741.9 nm范圍內(nèi)的比例分別為：0.4%，2.0%，5.2%，9.3%，13.5%，16.4%，17.1%，15.1%，11.1%，6.1%，2.0%。平均粒徑為(482.20±8.25)nm。而Zein-Lutein顆粒度大小范圍主要分布在198.0～859.2 nm范圍(表4)，比例分別為：1.3%，4.1%，8.1%，12.1%，15.1%，16.4%，15.5%，12.7%，8.7%，4.6%，1.5%，平均粒徑為(398.3±5.42)nm。由上述粒徑的測定結(jié)果可知，Zein與Zein-Lutein納米粒粒徑分布具有一致性，均在納米級范圍內(nèi)，且分布比較集中和均勻(如圖5所示)。Zein-Lutein顆粒大小分布變化較小，但所形成的納米顆粒粒徑略有減小，可能是Zein和葉黃素二者通過吸附和疏水部位緊密結(jié)合，減小了醇溶蛋白間的疏水性聚集作用，形成納米顆粒后在水中分散性有所改善，因此形成的納米粒徑有所減小[18]。

表3 Zein粒徑分布百分比Table 3 Percentage of particle size of Zein

表4 Zein-Lutein粒徑分布百分比Table 4 Percentage of particle size of Zein-Lutein

圖5 Zein和Zein-Lutein的粒徑分析圖Figure 5 Particle size distribution of Zein and Zein-Lutein

2.3.2 Zein-Lutein電位分析 納米粒子電位分析可反映出包埋前后電勢電位的變化。從圖6可知，玉米醇溶蛋白顆粒的平均電勢為(43.70±2.56)mV，而Zein-Lutein納米粒的平均電勢為(44.30±2.53)mV，電勢電位略有升高，說明帶有正電荷的葉黃素與Zein的結(jié)合后，所形成的納米粒帶電荷量增加，進(jìn)而說明Zein與Lutein能夠有效結(jié)合，形成對葉黃素的包埋作用。

2.4 透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果與分析

采用H-7650透射電子顯微鏡對Zein和Zein-Lutein微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖7所示，Zein呈球形顆粒狀態(tài)，大小分布比較一致，由于其疏水性較強(qiáng)在溶解液中呈聚集態(tài)，蛋白顆粒較大。當(dāng)Zein對Lutein進(jìn)行包埋以后，能夠形成Zein-Lutein納米復(fù)合體結(jié)構(gòu)，且粒徑變小，大小分布不均勻，與Nano粒徑分析儀測得結(jié)果一致。說明脂溶性葉黃素能夠與疏水性玉米醇溶蛋白結(jié)合，形成對葉黃素包埋的體系，同時改善了葉黃素的溶解分散性，有效地減小了葉黃素的降解和損失[19]。

圖6 Zein和Zein-Lutein的電勢電位分布Figure 6 Zeta potentiometric of Zein and Zein-Lutein

圖7 Zein和Zein-Lutein的透射電子顯微鏡圖Figure 7 Transmission electron microscope (TEM) of Zein and Zein-Lutein

2.5 傅里葉紅外光譜(FT-IR)解析

由圖8(a)可知，葉黃素在2 957 cm-1波數(shù)處有O—H伸縮振動吸收峰，在2 920，2 848 cm-1波數(shù)處有C—H伸縮振動吸收峰，在1 715 cm-1波數(shù)處有C═C伸縮振動吸收峰，此紅外光譜為葉黃素分子基團(tuán)的特征吸收光譜[20]。圖8(b)顯示出玉米醇溶蛋白的紅外特征吸收光譜：分別在3 406 cm-1波數(shù)處有O—H振動吸收峰，1 656 cm-1處有酰胺Ⅰ帶—NH彎曲振動，2 920 cm-1波數(shù)處有C—H伸縮振動吸收峰，在1 115 cm-1波數(shù)處有C—O伸縮振動的紅外特征吸收峰[21]。葉黃素經(jīng)玉米醇溶蛋白包埋后[圖8(c)]，分別在2 957，2 918，2 848，1 715 cm-1波數(shù)有特征伸縮振動吸收峰，該特征光譜證明了在玉米醇溶蛋白負(fù)載的納米粒中存在葉黃素結(jié)構(gòu)。而且在3 406 cm-1波數(shù)處O—H伸縮振動，2 920 cm-1波數(shù)處C—H伸縮振動和1 115 cm-1波數(shù)處有C—O伸縮振動吸收峰分別明顯增強(qiáng)。且在3 406 cm-1處的O—H伸縮振動峰移至3 422 cm-1處，在1 115 cm-1處的C—O伸縮振動吸收峰移至1 118 cm-1處。上述結(jié)果表明，葉黃素與玉米醇溶蛋白結(jié)合以后，并未明顯改變Zein的二級結(jié)構(gòu)，而是二者通過O—H鍵和C—O等疏水性基團(tuán)相互作用結(jié)合在一起，加強(qiáng)了葉黃素與Zein分子間的相互作用而形成納米結(jié)合體結(jié)構(gòu)[22]。因此，葉黃素與玉米蛋白是以包埋方式結(jié)合而形成的納米結(jié)構(gòu)體系。

圖8 葉黃素、Zein和Zein-Lutein的紅外光譜圖Figure 8 Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR)of Zein-Lutein

3 結(jié)論

本研究對反溶劑法制備玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒的工藝進(jìn)行了探討，并對其結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行了初步解析。得到了玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒的最佳制備工藝條件為：玉米醇溶蛋白與葉黃素質(zhì)量比20∶1，水合時間150 min，溫度50 ℃，此條件下玉米醇溶蛋白對葉黃素的包封率最大為81.0%。通過粒徑分析儀測得所制備的玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒粒徑分布在198.0～859.2 nm，平均粒徑為398.3 nm，平均電勢為44.3 mV；TEM顯示葉黃素充分被包裹在Zein內(nèi)部而形成納米球形結(jié)構(gòu)，在水溶液體系中分散性提高；通過Zein載入葉黃素后的FT-IR光譜特征證明了葉黃素能夠以氫鍵和疏水性作用嵌入Zein中形成納米結(jié)合體，并通過包埋作用對葉黃素進(jìn)行負(fù)載和保護(hù)，此納米體系中Zein的二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。因此，可將可食性的玉米醇溶蛋白作為有效載體制備玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素自組裝納米粒，對葉黃素進(jìn)行包埋和保護(hù)，可提高葉黃素的穩(wěn)定性和分散性，有助于保護(hù)葉黃素的生物活性和吸收利用率[23]。