蔣雨晴 遲玉杰

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

卵白蛋白是由385個(gè)氨基酸組成的球蛋白，因其具有良好的功能特性[1]，如起泡性、膠凝性、持水性和成膜性能等，被廣泛應(yīng)用于補(bǔ)鐵劑、酶處理劑、肽制劑、蛋白口服劑等領(lǐng)域，同時(shí)因其具有良好的成膠性和乳化性，也被廣泛應(yīng)用于烘焙、甜點(diǎn)和肉制品加工中[2]。隨著蛋清深加工、綜合利用的深入研究，雞蛋清中活性肽的提純技術(shù)日趨完善，卵白蛋白作為雞蛋清蛋白中含量最高的蛋白，其生物活性肽的生理活性受到廣泛關(guān)注，成為食品、醫(yī)藥保健品中重要的功能性肽原料。

抗菌肽作為一種新型食品防腐劑，因其抑菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性，且有較高熱穩(wěn)定性和低溫貯藏穩(wěn)定性，而受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[3]。目前抗菌肽的來(lái)源較廣，Hou等[4]從家蠅幼蟲(chóng)中提取出Hf-1，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)食源性致病菌有較強(qiáng)抑制作用。孟婷等[5]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶解的伴大豆球蛋白對(duì)沙門(mén)氏菌具有抑制作用。楊珮瑜等[6]采用蛋白酶水解法制備的黃鯽蛋白抗菌肽與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物與大腸桿菌作用1 h即可造成細(xì)胞膜損傷。而禽蛋因其富含蛋白質(zhì)成為分離天然或制備抗菌肽的研究對(duì)象[7]。Kobayashi等[8]用鏈霉蛋白酶處理卵黏蛋白，制得的水解物能與大腸桿菌特異性結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抑菌作用。卵白蛋白水解物的抑菌性也得到研究，其中唐文婷等[9]發(fā)現(xiàn)水解物對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有抑制性，其中對(duì)大腸桿菌的抑菌效果更為顯著。Pellegrini等[10]將卵白蛋白肽段與絲氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者有同源性的肽段序列。該序列對(duì)枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抑制性，對(duì)支氣管炎博德特菌、綠膿假單胞菌和黏質(zhì)沙雷氏菌有一定強(qiáng)度的抑制性。

目前關(guān)于抑菌機(jī)理的研究較多，大致可以歸納為以下幾類(lèi)：破壞細(xì)胞膜蛋白，抗菌肽阻斷細(xì)胞膜的合成或者抑制分子主動(dòng)運(yùn)輸[11]；胞質(zhì)凝結(jié)，抗菌肽穿過(guò)破壞的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜與胞內(nèi)目標(biāo)組分特異性結(jié)合，抑制蛋白、DNA等合成[12]；胞內(nèi)成分滲透[13]，破壞細(xì)胞正常繁殖代謝。

本試驗(yàn)擬探究對(duì)卵白蛋白源抗菌肽抗菌活性有顯著貢獻(xiàn)的寡肽結(jié)構(gòu)，通過(guò)胃蛋白酶酶解卵白蛋白制備具有抑菌活性的粗酶解物，進(jìn)而通過(guò)超濾、凝膠色譜及反相液相色譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到最佳抑菌效果的組分并分析其氨基酸序列，旨在為卵白蛋白源抗菌肽的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制，純度93.4%；

大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)：實(shí)驗(yàn)室保存菌株；

牛肉膏、蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)瓊脂：生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)：EYELAFDU-1100型，日本Rikakikai公司；

恒溫水浴鍋：DK-98電熱型，天津市泰斯特儀器有限公司；

精密pH計(jì)：pHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

分子篩：Superdex Peptide 10-300型，美國(guó)GE Healyhcare 公司；

質(zhì)譜儀：LTQ-Velos型，美國(guó)ThermoFinnigan 公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9123A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電導(dǎo)率儀：DDS-307 型，上海偉業(yè)儀器廠；

手提式壓力滅菌鍋：YX-160B 型，上海醫(yī)用核子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 卵白蛋白酶解 采用胃蛋白酶制備卵白蛋白源抗菌肽，依據(jù)本課題組預(yù)試驗(yàn)[14]，確定卵白蛋白源抗菌肽酶解最適條件為底物濃度3%，pH 2.0，水解時(shí)間4 h，反應(yīng)溫度37 ℃，此時(shí)水解度為83.52%。將得到的水解物在-30 ℃ 條件下預(yù)凍2.5 h處理，在-82 ℃，0.01 kPa條件下真空冷凍干燥。冷凍干燥處理后于4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 卵白蛋白源抗菌肽的分離純化

(1)超濾分離：依次采用截留分子質(zhì)量為10，3 kDa超濾膜對(duì)粗酶解得到的水解物進(jìn)行分離，根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改如下：其中料液溫度35 ℃，壓力0.15 MPa，超濾50 min 為1個(gè)周期。得到3個(gè)組分，分別編號(hào)為A1，A2，A3，其中A1(>10 kDa)，A2(3～10 kDa)，A3(<3 kDa)。將得到的組分進(jìn)行冷凍干燥處理，測(cè)其對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌抑菌圈及細(xì)胞膜通透性的影響。

(2)凝膠色譜分離：取超濾分離得到，具有最佳抑菌性的組分，經(jīng)過(guò)0.02 μm微超濾過(guò)濾后在蛋白純化系統(tǒng)中經(jīng)Superdex peptide 10/300(10×300 mm)凝膠色譜分離，分離條件根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH 7.0，等梯度洗脫，樣品濃度10 mg/mL，進(jìn)樣體積0.5 mL。收集各洗脫峰。將得到的組分進(jìn)行冷凍干燥處理后測(cè)其對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌圈及細(xì)胞膜通透性的影響。

(3)反相液相色譜分離：取凝膠色譜分離得到，并具有最佳抑菌性組分利用反向柱進(jìn)一步純化，色譜條件：柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相A為2%乙腈—水(含0.1%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%TFA)，洗脫梯度：0%～40% B，樣品濃度0.5 mg/mL，進(jìn)樣體積0.5 mL。多次收集合并各尖峰，測(cè)定其對(duì)菌液的抑菌性，選擇活性較高的組分進(jìn)行序列分析[17]。

(4)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定：采用二級(jí)色譜確定最終卵白蛋白源抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，色譜條件：C18柱(0.15 mm×150 mm)；洗脫液A(0.1%甲酸)、B(含0.1%甲酸的85%乙腈溶液)，流速60 μm/min。質(zhì)譜條件根據(jù)文獻(xiàn)[2]修改如下：噴霧電壓3.4 kV，源溫170 ℃，掃描范圍400～2 000 Da，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間1.5 min。

1.3.3 抗菌肽合成及活性 根據(jù)質(zhì)譜對(duì)氨基酸序列分析結(jié)果，委托旭帆生化公司采用Fmoc固相合成法，合成多肽。合成肽與步驟1.3.2(3)中制得的最佳抑菌肽段進(jìn)行抑菌性對(duì)比。

1.3.4 抗菌肽抑菌性測(cè)定

(1)抑菌圈直徑測(cè)定：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌配成105CFU/mL的懸濁液，均勻涂布至瓊脂培養(yǎng)基上。直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片在卵白蛋白、卵白蛋白水解物及各步驟分離純化得到的組分溶液中(蛋白濃度2.0 mg/mL)浸泡10 s后，置于培養(yǎng)基表面，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定樣品的抑菌圈直徑[18]。

(2)菌液電導(dǎo)率的測(cè)定：取105CFU/mL大腸桿菌或沙門(mén)氏菌菌液0.5 mL于15 mL無(wú)菌試管中，加入10 mL去離子水，分別添加質(zhì)量濃度為10 mg/mL的卵白蛋白、卵白蛋白水解物及各步驟分離純化得到的組分5 mL，在15 min時(shí)測(cè)定其電導(dǎo)率[19]。

(3)菌液還原糖含量的測(cè)定：取105CFU/mL大腸桿菌或沙門(mén)氏菌2.0 mL及2 mL樣品溶液(10 mg/mL)至乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h后取出，于6 000 r/min 離心15 min，取上層清液采用直接滴定法[20]測(cè)定還原糖含量。

(4)菌液可溶性蛋白的測(cè)定：取105CFU/mL大腸桿菌或沙門(mén)氏菌菌液10 mL，分別添加質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的樣品溶液2 mL，處理8 h后，取3 mL各處理組的菌液，在-20 ℃冰箱中冷凍12 h，加入0.01 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液，采用牛血清蛋白濃度—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定可溶性蛋白[21]，吸取0.1 mL各處理組菌液于10 mL試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250染色劑，混勻后放置2 min，在595 nm測(cè)定其吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)樣品的蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵白蛋白水解物的純化及其分離組分的抑菌性

2.1.1 超濾分級(jí)及其分離組分的抑菌性 當(dāng)微生物受到外界作用，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)小分子的離子(K+、Ca2+、Na+等)從細(xì)菌細(xì)胞中大量滲出，電解質(zhì)的滲漏會(huì)致使菌液電導(dǎo)率上升[22]；當(dāng)細(xì)胞膜被破壞至一定程度，較大分子量的還原糖會(huì)滲出，導(dǎo)致菌液中可溶性含量增加；可溶性蛋白是細(xì)胞生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)素之一，其數(shù)值的變化可反映菌體蛋白質(zhì)合成的情況[23]。卵白蛋白水解物通過(guò)兩步超濾依次透過(guò)10，3 kDa 超濾膜[17]，得到3個(gè)組分分別為A1(Mr>10 kDa)、A2(3 kDa

從圖1可知，抑菌圈直徑顯示A3相比粗水解物及其他組分對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌性最為明顯(P<0.05)。通過(guò)電阻率可知，粗水解物及其3種組分均可造成兩種菌體內(nèi)容物的滲漏，改變菌體的細(xì)胞膜通透性，從而使得菌液培養(yǎng)基的電阻率增加。且A3對(duì)兩種菌體的通透性影響顯著高于其他組分(P<0.05)，并對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性影響高于沙門(mén)氏菌。從可溶性蛋白和還原糖的含量變化可知，在相同濃度下A3對(duì)大腸桿菌蛋白合成的抑制作用最為明顯，且菌液滲透到胞外的還原糖最多，再次說(shuō)明A3對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有破壞作用。在相同濃度條件下，分子量小的組分，表現(xiàn)為較高的抑菌性，與Chen等[2]研究結(jié)果一致。因此選擇A3組分進(jìn)行下一步分離純化。其中A1、A2、A3肽得率分別為14.96%，15.27%，50.46%。

2.1.2 凝膠色譜分離及其分離組分的抑菌性 將A3組分經(jīng)過(guò)10/300凝膠色譜分離，結(jié)果如圖2所示，測(cè)分離得到的4個(gè)主要峰的抑菌性，分別標(biāo)記為B1、B2、B3、B4。

圖1 超濾分離組分的抑菌活性比較Figure 1 The antibacterial activity of each components on ultrafiltration

由圖2可知，B3峰面積最大，所占比例最多。其中4個(gè)組分對(duì)兩種菌的抑制作用，如圖3所示。由圖3可知，B3相比其他組分對(duì)兩種菌的抑菌性最為明顯，對(duì)比抑菌圈直徑，B3組分抑菌效果顯著超過(guò)粗水解物及其經(jīng)過(guò)凝膠色譜分離得到的其他組分(P<0.05)。通過(guò)對(duì)比電阻率可知，在相同濃度條件下B3組分對(duì)兩種菌體的細(xì)胞膜通透性改變最顯著(P<0.05)，其次為B1組分，最差為B2組分。其中添加了B3的兩種菌液培養(yǎng)基內(nèi)可溶性蛋白和還原糖的含量最高，對(duì)大腸桿菌通透性影響最為明顯。再次證明B3對(duì)兩種菌的細(xì)胞膜破壞作用最為明顯。因此選擇B3組分進(jìn)行下一步分離純化。其中B1、B2、B3和B4肽得率分別為21.38%，16.65%，47.01%，14.95%。

圖2 Superdex peptide 10/300 對(duì)A3組分的分離曲線Figure 2 Chromatogram of A3 separaed on Superdex peptide 10/300

圖3 Superdex peptide 10/300 分離組分的抑菌活性比較Figure 3 The antibacterial activity of each fraction separated on Superdex peptide

2.1.3 反相高效液相色譜分離及其分離組分的抑菌性

將凝膠色譜柱100/300分離得到的抗菌活性最高的B3組分經(jīng)過(guò)反相色譜進(jìn)一步純化。得到9個(gè)主要的吸收峰，如圖4所示，分管收集洗脫液，測(cè)定各組分對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌性，結(jié)果如圖5所示。

由圖4可知，C3峰面積最大，所占比例最多。從圖5可知，不同洗脫組分呈現(xiàn)出不同的抑菌能力，在所收集的9個(gè)組分中，C3和C6的抑菌圈直徑明顯超過(guò)其他組分(P<0.05)。通過(guò)對(duì)比電阻率可知，在相同濃度條件下，C3對(duì)兩種細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響最顯著(P<0.05)，其菌液中可溶性蛋白和還原糖的含量變化也最為顯著，并對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性影響高于沙門(mén)氏菌，證明C3對(duì)兩種菌的抑制作用最為明顯。而C6的抑菌能力略低于C3。

圖4 反相液相色譜對(duì)B3組分的分離曲線Figure 4 Chromatogram of B3 separaed on RP-HPLC

圖5 反相色譜柱分離組分的抑菌活性比較Figure 5 The antibacterial activity of each fraction separated on RP-HPLC

試驗(yàn)證明卵白蛋白水解物對(duì)全蛋液中常見(jiàn)的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均會(huì)破壞其細(xì)胞膜的通透性，抑制其蛋白質(zhì)合成，使菌液中的還原糖滲透出細(xì)胞，從而起抑制作用，與唐文婷等[9]、Pellerini等[10]的研究結(jié)果一致。

2.1.4 卵白蛋白源抗菌肽的質(zhì)譜鑒定和分析 圖6為經(jīng)RP-HPLC分離得到的C3組分在總離子圖中分別提取基峰得到MS/MS圖譜。C3組分進(jìn)行ESI-MS/MS分析，通過(guò)測(cè)序的方法得到一個(gè)具有很高抑菌性的肽段，氨基酸序列為Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe-Gln，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為898.42 Da。

圖6 C3組分的串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 6 Tandem mass spectrum of peak C3

2.2 卵白蛋白源抗菌肽的固相合成及活性驗(yàn)證

在得到C3組分的氨基酸序列后，合成抗菌肽GLESINFQ，其純度為95.84%，相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)際為887.83 Da。

由圖7可知，經(jīng)過(guò)固相合成的抗菌肽與C3組分對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的抑制能力無(wú)顯著性差異(P>0.05)，從而證明卵白蛋白源抗菌肽發(fā)揮抑菌活性的成分主要為GLESINFQ肽段。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)酶解卵白蛋白制備具有抑菌活性的粗酶解物。通過(guò)超濾、凝膠色譜分離技術(shù)得到具有較強(qiáng)抑菌性的B3組分，進(jìn)而采用反相高效液相色譜純化B3組分，得到純化的9個(gè)組分，其中C3組分抑菌性最強(qiáng)。最終鑒定出氨基酸序列為Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe-Gln(GLESINFQ)的抑菌肽是卵白蛋白源抗菌肽發(fā)揮抑菌活性的主要成分，其分子質(zhì)量為887.83 Da。該肽經(jīng)固相合成純度為95.84%，合成肽抑菌活性與C3組分無(wú)顯著性差異。為卵白蛋白的深度開(kāi)發(fā)及其抗菌肽的綜合利用提供理論依據(jù)。本研究?jī)H限于卵白蛋白源抗菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌活性的抑制效果，而未探討制備的抗菌片段對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制影響，后續(xù)可研究抗菌片段對(duì)金黃色葡萄球菌等食品中常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性致病菌的抑制作用。

圖7 C3組分與合成肽的抑菌活性比較Figure 7 The antibacterial activity of the C3 and synthetic peptide