成亞琳 曾繼濤 黃敏 劉俊銀 涂小林 劉宏*

1．重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕癥中心，重慶400016

2．成都市第五人民醫(yī)院，四川成都611130

3．重慶醫(yī)科大學生命科學研究院骨發(fā)育與再生實驗室，重慶400016

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于脂肪組織、骨髓、骨外膜、肌肉等［1-2］的，具有成骨、成軟骨、成脂、成肌等多系分化潛能的有自我更新能力的干細胞［3-5］，是再生醫(yī)學骨組織修復的重要研究目標［6］。C3H10T1/2細胞是從C3H小鼠分離建立的間充質(zhì)干細胞株，是組織工程骨常用材料之一，研究不同信號通路在間充質(zhì)干細胞成骨分化中的相互作用是組織工程骨研究的重要途徑。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β)超基因家族的重要成員之一，大量研究均證明它在出生后骨形成、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中扮演著重要角色。自19世紀60年代由Urist發(fā)現(xiàn)并命名［7-8］至今，已鑒定并克隆出20多種成員，其中BMP2、4、7已被臨床用于骨折、骨不連等的輔助治療。BMP9又稱為生長分化因子2或GDF2［9］，最先在胎鼠肝臟中分離得到［10］，其前體與BMP2、4、5、6、7 有 50%～55%的相同氨基酸序列［11］，以自分泌和旁分泌形式分泌［12］，其在維持血管壁的完整性［13］、抑制心肌纖維化［14］、抑制肝纖維化［15］、誘導成骨分化［16］等方面具有重要作用。BMP9作為最具潛力的誘導成骨分化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一［17］，部分BMP包括BMP4和BMP7已在臨床中廣泛用于骨缺損、骨再生及脊柱融合術(shù)［18-19］。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，特征是骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加并易于骨折。以前的研究認為，PMOP主要原因是雌激素水平的降低，且雌激素用于其治療可降低骨量丟失。但近10年的研究發(fā)現(xiàn)［20］，在圍絕經(jīng)期，雌激素水平尚維持在正常范圍，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)已顯著升高，且此期骨量丟失較絕經(jīng)后骨量丟失更高，提示FSH與PMOP有強烈相關(guān)性。FSH是來源于垂體前葉的促性腺激素，包括α和β兩個亞基，其中β亞基是發(fā)揮其特異性功能的主要組成部分［21］，調(diào)節(jié)卵泡生長和成熟［22］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其除與生殖功能相關(guān)外，還與絕經(jīng)后內(nèi)臟性肥胖［23］、骨的重塑密切相關(guān)。部分學者認為［24］，F(xiàn)SH-β主要通過增強骨的吸收來促進PMOP的發(fā)生;而Allan等［25］則發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH-β 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠能促進骨的形成。因此，F(xiàn)SH對骨的重塑功能和機制尚存爭議。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ在BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中起到促進作用，但具體機制并不明確。

Notch是至關(guān)重要的生長發(fā)育信號。當鄰近細胞的受體與配體結(jié)合激活Notch信號后，Notch受體在 腫 瘤 壞 死 因 子 α 轉(zhuǎn) 化 酶 (TNF-α convertingenzyme，TACE) 和 γ-促 分 泌 酶 (γsecretase)/早老素(presenilin，PS)兩次裂解下，生成胞內(nèi)域(intracellular notch，ICN)進入細胞核，調(diào)控靶基因(Hes1/5/7、Hey1/2/L)轉(zhuǎn)錄。有研究認為，內(nèi)皮來源的Notch能調(diào)控骨內(nèi)血管和骨的生成［26］;也有研究認為，Notch信號能通過抑制間充質(zhì)干細胞成骨分化來維持骨髓中的干細胞數(shù)量［27］，表明Notch信號在骨中的作用錯綜復雜。此外，許多研究證實［28-29］，γ-促分泌酶的抑制劑 DAPT 是 Notch信號的特異性抑制劑，通過阻斷Notch信號，調(diào)節(jié)其在骨生長發(fā)育中的作用。有相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，Notch信號也在BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中扮演著重要作用［11］，但對FSHβ增強BMP9促進間充質(zhì)干細胞成骨分化中的影響未見報道。

因此，本研究旨在探討Notch信號在FSHβ增強BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中的具體作用，進一步拓寬FSHβ在骨骼方面的研究，為骨折、骨不連、骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試劑與細胞培養(yǎng)

C3H10T1/2細胞和人胚胎腎上皮細胞-293T均購買于 American Type Culture Collection(ATCC)。細胞在 DMEM培養(yǎng)基:高糖(90%)、胎牛血清(10%)、鏈霉素(100 mg/L)和青霉素(100 kU/L)中培養(yǎng)，并置于37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中生長。本實驗中使用的堿性磷酸酶染色試劑盒購買于碧云天生物科技有限公司;茜素紅S染料購買于塞米克生物科技有限公司;所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購買于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;TRIzol購買于賽默飛世爾科技有限公司;DAPT購買于Sigma-Aldrich公司。

1.2 目標重組腺病毒(GFP、BMP9、FSHβ)構(gòu)建

采用AdEasy系統(tǒng)［30］構(gòu)建本研究中需要用到的重組腺病毒Ad-GFP、Ad-BMP9和Ad-FSHβ，所有上述3種重組腺病毒均表達綠色熒光蛋白，其中Ad-GFP用作對照組。利用293T細胞擴增腺病毒。

1.3 實驗分組與重組腺病毒滴度、藥物濃度測定

根據(jù)研究目的將實驗分為對照組(Ad-GFP)和實驗組(Ad-FSHβ、Ad-BMP9和 Ad-BMP9+Ad-FSHβ)。在實驗前，將對數(shù)生長期C3H10T1/2細胞以適當密度(約5×105/孔)接種于24孔板，貼壁后，按不同倍數(shù)稀釋重組腺病毒，以如下體積:0.1、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0 μL/孔感染細胞，24 h后觀察綠色熒光，選定重組腺病毒感染率所需稀釋倍數(shù)，并根據(jù)研究目的選擇最佳感染率。最后根據(jù)實驗設(shè)計將不同濃度的DAPT加入聯(lián)合感染腺病毒組，根據(jù)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色結(jié)果確定藥物的最佳使用濃度。

1.4 ALP表達檢測

將對數(shù)期生長C3H10T1/2細胞以適當密度(約5×105/孔)接種于24孔板，細胞貼壁后，加入對照組和實驗組選定滴度的重組腺病毒或者藥物，并于第5天按照試劑盒的使用說明對細胞進行ALP染色。各組實驗重復3次。

1.5 茜素紅S染色測定鈣鹽結(jié)節(jié)

將對數(shù)期生長C3H10T1/2細胞以適當密度(約5×105/孔)接種于24孔板，細胞貼壁后，按研究目標分別加入實驗組和對照組的重組腺病毒感染細胞，并于病毒感染細胞后第3天將普通培養(yǎng)基更換為工作濃度為 10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 μg/mL維生素C的選擇培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至21 d后按照說明書進行茜素紅S染色。每組實驗重復3次。

1.6 細胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及實時熒光定量PCR實驗

將對數(shù)期生長C3H10T1/2細胞以適當密度(約5×105/孔)接種于24孔板，細胞貼壁后，按研究目標分別加入相應的處理因素，于指定時間點(腺病毒感染后第5天)采用TRIzol法從各組細胞中提取總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，最后采用Q-PCR技術(shù)測定相應目的基因mRNA的表達水平。每組實驗重復3次。各目的基因引物序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences table of Q-PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

本研究使用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并用平均值±標準差(珋x±s)表示;組間比較通過Studen t-test進行，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 C3H10T1/2細胞感染重組腺病毒后相應腺病毒mRNA的表達檢測和ALP檢測

C3H10T1/2細胞在各組腺病毒(Ad-GFP、Ad-FSHβ及Ad-BMP9)感染48 h后提取總RNA并檢測FSHβ和BMP9 mRNA的表達水平。利用Q-PCR方法檢測后，分析其mRNA表達水平的相對定量值;于腺病毒處理5 d后利用ALP染色方法觀察細胞中ALP的表達變化。結(jié)果顯示，BMP9處理組較GFP對照組BMP9 mRNA表達水平顯著增高，F(xiàn)SHβ處理組較GFP對照組FSHβ mRNA表達水平顯著增高，且差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖1A、1B);此外，ALP染色顯示，BMP9處理組 ALP染色較GFP對照組深(圖1C);而FSHβ處理組ALP染色較GFP對照組無顯著改變(圖中未顯示)。提示各腺病毒成功感染C3H10T1/2細胞并表達，且BMP9能誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化，而單獨的FSHβ則無誘導其成骨功能。

2.2 FSHβ增加 BMP9誘導 C3H10T1/2細胞的ALP表達

骨中ALP活性與骨的鈣化作用密切相關(guān)，是評價間充質(zhì)干細胞成骨分化的早期指標。本研究利用各組重組腺病毒(Ad-GFP、Ad-FSHβ及Ad-BMP9)感染C3H10T1/2細胞5 d后的ALP表達進行檢測。結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ處理組較GFP對照組ALP染色無顯著區(qū)別，提示FSHβ對誘導ALP的表達無顯著影響;而BMP9處理組較對照組 ALP染色深，提示BMP9能顯著誘導 ALP的表達。此外，BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組較BMP9處理組ALP染色進一步加深(圖2)，提示FSHβ能增強BMP9誘導的ALP的表達。

圖1 GFP、BMP9和FSHβ重組腺病毒分別感染C3H10T1/2細胞后48 h相應mRNA表達水平及5 d后ALP表達檢測(100×) A:Q-PCR結(jié)果顯示BMP9重組腺病毒感染C3H10T1/2細胞48 h后BMP9 mRNA表達水平(n=3，t-test，＊＊P=0.0006 vs GFP組);B:Q-PCR結(jié)果顯示FSHβ重組腺病毒感染C3H10T1/2細胞48 h后FSHβ mRNA表達水平(n=3，t-test，＊＊P=0.0004 vs GFP組);C:ALP染色結(jié)果顯示BMP9重組腺病毒感染C3H10T1/2細胞5 d后ALP表達(100×)Fig．1 Corresponding mRNA expression levels of GFP，BMP9 and FSHβ recombinant adenoviruses treated C3H10T1/2 cells at 48 h and ALP expression at 5 d(100×)．A:Q-PCR analysis of BMP9 mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with BMP9 recombinant adenovirus for 48 h(n=3，t-test，＊＊P=0.0006 vs GFP group);B:Q-PCR analysis of FSHβ mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with FSHβ recombinant adenovirus for 48 h(n=3，t-test，＊＊P=0.0004 vs GFP group);C:The ALP staining of C3H10T1/2 cells treated with BMP9 recombinant adenovirus for 5 d(100 ×)．

圖2 光學顯微鏡下各組ALP染色情況(100×)Fig．2 The ALP staining in each group by the light microscope(100×)

2.3 FSHβ增強BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨中鈣鹽的沉積

在間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞和骨細胞期間，隨著細胞繼續(xù)分化，骨基質(zhì)礦化不斷增多，與之相關(guān)的鈣鹽沉積也會增加，因而鈣鹽結(jié)節(jié)成為成骨分化的晚期標志物?；诒狙芯吭缙诔晒欠只瘶酥疚锏谋磉_情況，進一步檢測相同處理下各組鈣鹽沉積情況。結(jié)果顯示，GFP和FSHβ處理組無明顯的鈣鹽結(jié)節(jié)形成，而BMP9處理組有明顯的鈣鹽結(jié)節(jié)形成，證實BMP9確有促進成骨的功能;而BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組，鈣鹽結(jié)節(jié)的形成量較BMP9處理組顯著增加(圖3)。綜上，提示FSHβ增加BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中鈣鹽的沉積。

圖3 光學顯微鏡下FSHβ對BMP9誘導C3H10T1/2細胞的鈣鹽沉積影響(100×)Fig．3 Effect of FSHβ on BMP9-induced calcium deposition in C3H10T1/2 cells under light microscopy(100×)

2.4 FSHβ增強BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化中Notch信號的表達

根據(jù)實驗設(shè)計，本研究利用各組腺病毒感染細胞5 d后對相關(guān)信號靶基因 mRNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)Notch信號靶基因Hey1 mRNA的表達水平顯著增加。如圖4所示，利用Q-PCR方法檢測后，分析其mRNA表達水平的相對定量值。結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ處理組較GFP對照組Hey1 mRNA表達無顯著變化，BMP9處理組較GFP對照組Hey1 mRNA的表達顯著增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組較BMP9處理組Hey1 mRNA的表達進一步增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖4)。提示FSHβ能增加BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中Hey1 mRNA的表達水平，即Notch信號的表達。

圖4 FSHβ對BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞中Notch信號靶基因Hey1 mRNA表達水平的影響。Q-PCR結(jié)果顯示重組腺病毒感染C3H10T1/2細胞5 d后Hey1 mRNA 表達水平(n=3，t-test，＊＊ P＜0.0001 vs GFP組;##P=0.0032 vs BMP9組)Fig．4 Effect of FSHβ on the expression of Notch signaling target gene Hey1 mRNA in BMP9-induced mesenchymal stem cells．Q-PCR analysis of Hey1 mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with recombinant adenovirus for 5 d(n=3，t-test，＊＊ P ＜0.0001 vs GFP group;##P=0.0032 vs BMP9 group)．

2.5 DAPT抑制FSHβ增強BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化中ALP的表達

為了研究 Notch信號通路抑制劑DAPT(10 μmol/L)是否能有效抑制FSHβ增強BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化，從而證實Notch信號通路在其中扮演著重要作用。將對數(shù)生長期的C3H10T1/2細胞鋪在24孔板中，貼壁后將各組重組腺病毒及DAPT(10 μmol/L)分別按研究計劃處理細胞，培養(yǎng)5 d后進行ALP染色。如圖5所示，BMP9能顯著增加ALP染色，F(xiàn)SHβ與BMP9聯(lián)合處理組ALP染色則較BMP9單獨處理組進一步增加，而在加入處理因素DAPT后，BMP9與DAPT聯(lián)合處理組ALP染色較BMP9單獨處理組降低，同時BMP9與FSHβ、DAPT聯(lián)合處理組較BMP9與FSHβ處理組ALP染色也顯著降低。提示DAPT能抑制BMP9促進間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用，也能抑制FSHβ增強BMP9促進間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用，從而反向證實Notch信號在FSHβ增強BMP9促進間充質(zhì)干細胞成骨分化中起到重要作用。

2.6 DAPT抑制FSHβ增強BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化中Notch信號的表達

為了進一步驗證 Notch信號在 FSHβ增強BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化過程中扮演的重要角色，將對數(shù)生長期的C3H10T1/2細胞鋪在24孔板中，貼壁后將各處理因素按研究計劃處理細胞，培養(yǎng)5 d后提取細胞總RNA，采用Q-PCR檢測Notch信號靶基因Hey1 mRNA表達。如圖6所示，BMP9處理組Hey1 mRNA表達較GFP處理組顯著升高(P＜0.01)，BMP9與FSHβ處理組Hey1 mRNA表達較BMP9處理組進一步升高(P＜0.05)，而在加入處理因素 DAPT(10 μmol/L)后，BMP9與 DAPT處理組Hey1 mRNA的表達較BMP9處理組降低(P＜0.05);同時，BMP9與 FSHβ、DAPT 聯(lián)合處理Hey1 mRNA的表達也較BMP9與FSHβ處理組降低(P＜0.05)。提示 DAPT能抑制 BMP9促進C3H10T1/2細胞成骨分化中Notch信號的表達，也能抑制FSHβ增強BMP9促進C3H10T1/2細胞成骨分化中Notch信號的表達，進一步證實Notch信號在FSHβ協(xié)同BMP9促進間充質(zhì)干細胞成骨分化中起著重要作用。

圖5 光學顯微鏡下各組ALP染色情況(100×)Fig．5 The ALP staining in each group by the light microscope(100×)

圖 6 Q-PCR檢測 DAPT(10 μmol/L)對 FSHβ 協(xié)同BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化中Hey1 mRNA表達的影響。Q-PCR結(jié)果顯示不同處理因素處理C3H10T1/2細胞5 d后Hey1 mRNA表達水平(n=3，ttest，＊＊P＜0.0001 vs GFP 組;＆P=0.0226 vs BMP9 組;#P=0.0206 vs BMP9組;$P=0.0197 vs BMP9+FSHβ組)Fig．6 Q-PCR detection of the expression of Hey1 mRNA in the osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells induced by FSHβ， BMP9 and DAPT(10 μmol/L)． Q-PCR analysis of Hey1 mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with different processing factors for 5 d(n=3，t-test，＊＊ P＜0.0001 vs GFP group;＆P=0.0226 vs BMP9 group;#P=0.0206 vs BMP9 group;$P=0.0197 vs BMP9+FSHβ group)

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是臨床上絕經(jīng)后女性常見的骨骼疾病，其防治一直是世界性難題。既往的研究認為，絕經(jīng)后女性雌激素水平降低是骨質(zhì)疏松的主要原因，雌激素替代療法可以有效保護骨質(zhì)流失［31］。然而，伴隨乳腺癌等副作用出現(xiàn)［20］，安全有效的治療藥物亟待解決。近期研究發(fā)現(xiàn)，PMOP除與雌激素水平降低有關(guān)外，也與FSH水平升高有密切關(guān)系:當女性FSH水平超過35 IU/L時，較FSH 8 IU/L的骨密度顯著降低［32］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH可能在骨的生成中發(fā)揮雙重作用，但具體機制并不明確［24-25］。

間充質(zhì)干細胞來源廣泛，具有多向分化潛能，自我更新能力強，是目前組織工程骨研究的理想種子細胞。研究證實，除破骨細胞外，間充質(zhì)干細胞上也有與Gi2α偶聯(lián)的FSH受體(FSHR)的存在，其可能通過ERK1/2磷酸化來抑制其向成骨細胞方向的分化［20］。然而，與 FSH誘導骨丟失相反的是，在TgFSH小鼠中，升高的FSH能以間接的方式增加骨小梁中的成骨細胞表面積，從而增加骨的合成代謝，且與雌激素水平無關(guān)［25］;另外，骨髓間充質(zhì)干細胞移植可挽救卵巢功能不全所引起的FSH增加［33］。因此，F(xiàn)SH可能對間充質(zhì)干細胞存在雙向調(diào)節(jié)作用。此外，BMPs是間充質(zhì)干細胞成骨分化的重要誘導因子，并已有成員被允許用于臨床輔助治療骨折、骨不連等［34］。然而，BMP9作為BMPs中成骨作用最強的成員之一，在動物模型中也在促進脊柱融合、骨不連修復中起著重要作用［35］，但相關(guān)機制有待深入研究。

BMPs對FSH的作用也受到廣泛關(guān)注，且不同成員對FSH功能產(chǎn)生不同甚至相反的影響。在母羊垂體中，BMP4能以劑量依賴性的方式通過BMP/SMAD4經(jīng)典途徑抑制FSHβ mRNA表達，降低FSH濃度［36］;而小鼠垂體細胞系中，BMP2卻以經(jīng)典BMP信號途徑方式刺激FSHβ的表達，且活化素A能協(xié)同刺激其轉(zhuǎn)錄［37］。以上研究表明，BMPs與FSH在不同的種系和細胞中存在不同的相互作用。BMP9作為BMPs家族的成員之一，且具有較強的成骨誘導功能，筆者猜想，F(xiàn)SH在BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中可能也有作用，但既往的研究著眼于BMP經(jīng)典信號通路上，對其他相關(guān)通路的研究并不多見。

Notch信號通路是五大發(fā)育信號之一，在血管生成［38］、腫瘤發(fā)生［39］、免疫調(diào)節(jié)［40］中扮演重要作用，也與骨骼發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號增強BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化［17］，Cao等也證實Notch在BMP9誘導的成骨分化中起重要作用;此外，Sharff等［41］發(fā)現(xiàn) Hey1在其中發(fā)揮重要作用。因此，本研究猜想，Notch信號傳導途徑也可能在FSHβ增強BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中起重要作用。本研究以 MSCs細胞系 C3H10 T1/2細胞為研究對象，將重組腺病毒 BMP9和FSHβ感染細胞，研究Notch信號轉(zhuǎn)導途徑在FSHβ增強BMP9誘導MSCs成骨分化過程中的變化，并將該信號阻斷后反向證實其在該過程中的重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨的FSHβ表達組對MSCs中ALP表達并未產(chǎn)生影響，BMP9卻能明顯增加其表達，而聯(lián)合處理組則能在BMP9的基礎(chǔ)上使其表達進一步增加，表明FSHβ能增強BMP9誘導MSCs成骨分化(圖2)。在鈣鹽沉積實驗的檢測中，結(jié)果呈現(xiàn)相似的變化(圖3)。進一步檢測相關(guān)信號通路靶基因的表達后發(fā)現(xiàn)，Notch信號靶基因Hey1 mRNA表達，在單獨的FSHβ處理組較GFP對照組并未產(chǎn)生影響，而單獨的BMP9處理組較GFP對照組則顯著增加其表達，BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組則較BMP9單獨處理組表達量增加(圖4)。運用DAPT(10 μmol/L)藥物阻斷Notch通路后對細胞進行ALP染色發(fā)現(xiàn)，BMP9與 DAPT聯(lián)合作用組較 BMP9作用組ALP染色降低，BMP9、FSHβ和 DAPT聯(lián)合作用組較BMP9和FSHβ聯(lián)合作用組ALP染色也降低，即ALP表達在加DAPT處理后被逆轉(zhuǎn)，表明DAPT能夠抑制BMP9與FSHβ誘導MSCs的ALP表達增加(圖5)。進一步檢測Notch信號靶基因Hey1 mRNA的表達，BMP9與DAPT聯(lián)合作用組較BMP9作用組Hey1 mRNA表達降低，BMP9、FSHβ和DAPT聯(lián)合作用組較BMP9和FSHβ聯(lián)合作用組Hey1 mRNA表達也降低，即Hey1 mRNA表達在DAPT處理后被逆轉(zhuǎn)，表明DAPT能夠抑制FSHβ增強BMP9誘導MSCs成骨分化中Hey1 mRNA表達增加(圖6)。因此，該研究證實，Notch信號在FSHβ增強BMP9誘導MSCs成骨分化中起重要作用，但涉及的Notch信號過程中的分子機制有待進一步研究。因此，本課題組擬對Notch信號通路中涉及的受體、配體和酶等進行檢測，為FSHβ增強BMP9誘導MSCs成骨分化提供具體的機制，為治療由于絕經(jīng)后卵泡刺激素水平增高引起的骨質(zhì)疏松癥的治療提供可靠的理論依據(jù)。

致謝:感謝重慶醫(yī)科大學生命科學研究院骨發(fā)育與再生平臺對本研究的大力支持。